Огурец дружная семейка f1 отзывы: Сорт огурца Дружная семейка (F1): фото, отзывы, описание, характеристики.

Забавный факт: мы думаем, что вы красивы такими, какие вы есть, но если у вас просто один из таких дней, отправляйтесь в сад и сорвите несколько своих огурцов Excelsior. Нанесение огурцов на глаза может уменьшить отечность и круги, в то время как натирание огурцом целлюлита может привести к тому, что коллаген в вашей коже подтянется, сглаживая эти надоедливые проблемные области!

Ресурсы для домашнего садоводства | Расширение штата Пенсильвания

Мечтаете о красивом, здоровом и продуктивном домашнем саду? Вырастите сад, который вы всегда хотели, с помощью домашних садовых ресурсов Penn State Extension.Изучите лучшие способы посадки и выращивания цветов, фруктов и овощей; и управлять садовыми вредителями, болезнями растений и сорняками. Узнайте о садоводстве для опылителей, о том, как привлечь диких животных на свой задний двор, об изменениях почвы в саду и многом другом.

Садоводство для начинающих: с чего начать садоводство

Сад доставляет массу удовольствия. Он должен быть не только красивым, но и продуктивным. Посадка и выращивание домашнего сада не является точной наукой. Тем не менее, есть вещи, которые вы можете сделать, чтобы увеличить свои шансы на успех.

Качество почвы и борьба с садовыми сорняками являются ключом к вашему успеху. Также важно знать, что делать с вредителями в вашем саду, поскольку они могут стать худшим кошмаром садовника. Существует ряд решений для конкретных проблем с садовыми вредителями, но профилактика часто лучше, чем лечение. Один из вариантов — использовать приподнятые грядки.

Люди выбирают сад по разным причинам. Красивый сад может повысить привлекательность вашего дома, а также может привести к более здоровому образу жизни.Какой бы ни была причина для создания сада, это требует терпения, базовых знаний о типах растений и садовой терминологии, а также правильного ухода за почвой. Разговаривая с другими садоводами, вы также можете столкнуться с некоторыми популярными садовыми мифами. Penn State Extension раскрывает настоящую правду, стоящую за многими ошибочными представлениями о садах.

Сад без растений не сад. Если вы хотите создать и поддерживать здоровый ландшафт, очень важно выбирать растения, которые хорошо подходят для условий вашего двора.Может показаться заманчивым начать с покупки заводов по расчистке, особенно если вы работаете с ограниченным бюджетом, но есть шаги, которые необходимо выполнить.

Если вы хотите сэкономить деньги, можно использовать размножение. Лучшее время года для начала посадки семян однолетних, многолетних и овощных культур – весна. Размножение — это не только посадка семян — вы также можете выращивать растения черенкованием, отводками и делением.

Садоводство – круглогодичное занятие. Всегда что-то происходит и что-то нужно сделать, независимо от сезона.Зима — время поразмышлять об успехах и неудачах прошлогоднего сада. Весна — время для того, чтобы начать подготовку своего сада к летнему сезону. Осенью пора заняться уборкой и подготовкой сада к зиме.

То, что вы решите выращивать в своем саду, во многом зависит от вашего стиля садоводства. Вы хотите, чтобы кустарники придавали вашему саду средиземноморский вид? Хотели бы вы включить декоративные растения, которые придадут вашему саду более японский вид? Другие стили сада включают контейнерное садоводство, колониальный стиль садоводства, который включает в себя классическое функциональное выращивание трав и овощей, а также домашнее фруктовое садоводство.

Советы и советы по домашнему садоводству

Вы никогда не одиноки, когда начинаете заниматься садоводством. В Интернете доступно множество полезной информации, в том числе мастера-садоводы, желающие поделиться своими обширными знаниями в письменных руководствах и на конференциях домашних садоводов.

Если вы хотите попробовать выращивать фрукты в домашнем саду из яблонь и груш, выращивать и собирать вкусные овощи или начать свой бизнес по выращиванию декоративных растений и цветов, Penn State Extension предлагает широкий выбор ресурсов, охватывающих все, от основ садоводства. и пчеловодство, вплоть до трав для домашнего садовода, домашнего компостирования и того, какие местные растения можно выращивать круглый год.

Вредители являются проблемой для всех садоводов, и хотя вы можете мириться с небольшим ущербом, иногда необходимо принимать меры по борьбе с вредителями. Вредители бывают всех форм и размеров, некоторые из которых считаются инвазивными видами. Одним из примеров является пятнистая муха-фонарь. Но не все насекомые являются вредителями. Мухи семейства Syrphidae — очень полезные помощники в саду и лишь одно из многих полезных насекомых.

Мастер-садовник Обучение и ресурсы

Когда вы становитесь главным садовником, вы также становитесь частью гораздо более широкого сообщества.Садоводство — это обмен опытом садоводства и информацией о садоводстве, а также поощрение молодых людей узнавать о посадках через различные вебинары для садоводов.

Если вы хотите помочь другим в их садоводстве, вы можете стать мастером-садовником. Программа Master Gardener началась в 1972 году, а в 1982 году ее принял Университет штата Пенсильвания.

На курсах мастеров-садовников рассматривается широкий спектр методов садоводства, но начинается он с базовой подготовки мастеров-садовников. Другие затронутые темы включают:

Рецепт салата из лондонского жаркого с луком и огурцами | Джастин Чаппл

Убрать выделение со всего

Один круглый стейк весом 2 фунта для лондонского гриля (толщиной около 2 дюймов), выдержанный при комнатной температуре в течение 30 минут.

Кошерная соль и свежемолотый черный перец

2 столовые ложки соевого соуса

1 1/2 столовой ложки поджаренного кунжутного масла

Один 2-дюймовый свежий имбирь, очищенный и мелко натертый

4 зубчика чеснока, мелко натертого

2 чайные ложки сахара

3 персидских огурца

1 маленькая красная луковица

3 столовые ложки рисового уксуса

3 столовые ложки рапсового или растительного масла

2 1/2 унции смешанных молодых салатов

Купить растения огурцов онлайн — вырастить огурцы самостоятельно

Информация о выращивании огурцов

В жаркий летний день нет ничего лучше прохладного хруста домашнего огурца! Их можно выращивать различными способами, от комнатных горшков до уличных в земле, и употреблять в салатах, настаивать в воде или мариновать и хранить в банках, чтобы наслаждаться.

Основные факты об уходе за огурцами

• Разные сорта требуют разных методов выращивания
• Прищипывание способствует кустистости
• Растения следует дрессировать с использованием опор для растений, таких как вертикальная трость или решетка
• Требуют регулярного полива
• Еженедельная подкормка пойдет на пользу, как только начнут набухать первые плоды
• Требуется мониторинг белокрылки, вируса мозаики и мучнистой росы

Где выращивать огурцы?

Комнатные сорта огурцов необходимо выращивать под стеклом.Для аутдорных сортов требуется теплое солнечное место с защитой от холодных ветров.

Как выращивать огурцы?

Огурцы можно выращивать в мешках, горшках или прямо в почве. Приучите их вверх по вертикальной трости или шпалере и с комнатными растениями прищипните кончики, когда они достигнут крыши. Прищипните кончики боковых побегов, так как это будет способствовать развитию большего количества побегов.

Растения огурца производят плоды с высоким содержанием воды, поэтому они жаждущие растения. Регулярно поливайте и подкармливайте раз в неделю, когда начнут набухать первые плоды.С комнатными растениями огурцов поддерживайте высокую влажность, опрыскивая пол водой.

Когда собирать огурцы?

Регулярно собирайте урожай с начала августа, так как это будет стимулировать растение продолжать собирать урожай. Когда плоды достигнут длины 15-20 см, срежьте их с плодоножки с помощью острого ножа. Обрезка будет продолжаться до конца августа.

Как есть огурцы

Хрустящие, сырые огурцы очень вкусны, если их добавить в салат или подавать как сыроедение с соусом.Бутерброды с огурцами рисуют очень английскую картину сада с выдолбленными кусочками огурца, наполненными сливочным сыром или чем-то подобным, что делает вкусный перекус. Кроме того, вы можете замариновать более мелкие сорта огурцов в банке, чтобы создать свои собственные корнишоны для гамбургеров, начинки для сэндвичей и многого другого.

Питательная ценность огурцов

Мало того, что свежие огурцы имеют прекрасную хрустящую текстуру, они также низкокалорийны и хорошо увлажняют. Огурцы богаты антиоксидантами и будут способствовать ежедневному рекомендуемому потреблению калия, клетчатки и витамина С.

Вас также могут заинтересовать семена огурцов Suttons и других популярных овощных растений. Suttons предлагает большой выбор огурцов для продажи, так что найдется огурец, подходящий для любого открытого пространства.

Купить растения огурца в Великобритании в Suttons

Классическая генетика и традиционная селекция огурца (Cucumis sativus L.)

2. Классическая генетика огурца

2.1 Генетика количественных и качественных признаков

Глубокое понимание биологии огуречных культур стало возможным только благодаря менделевской классической генетике, которая позволило селекционерам огурцов вывести улучшенные сорта и гибриды F ₁ .Знание о различных генах, влияющих на экономические признаки, помогло селекционерам разработать надлежащие генетические ресурсы для создания генетического фонда с конкретными признаками для дальнейшего использования для генетического улучшения огурца. Например, размер популяции будет намного меньше, если селекционер отбирает признак, контролируемый одним геном, чем если этот признак контролируется несколькими генами с большим влиянием окружающей среды. Применение менделевской генетики с использованием классических методов для огурцов способствовало открытию ряда генов урожайности, качества, архитектуры растений, а также устойчивости к болезням и вредителям как при нарезке, так и при мариновании огурцов.Урожайность огурцов увеличивается за счет использования гинекологических растений в качестве одного из родителей в программе разведения, что способствует более высокому соотношению полов самок и самцов. Соотношение полов (самка:мужчина), масса и размер плодов являются непосредственными компонентами урожая при селекции огурцов.

2.2 Выражение пола

Для коммерческих сортов огурца тип половых форм (гинодомные или однодомные) и степень их выраженности имеют важное значение, поскольку они оказывают прямое влияние на сроки сбора урожая, продуктивность и продуктивность этой культуры. Время цветения огурца сыграло решающую роль в получении ранней рыночной цены и увеличении урожая плодов для производителей. У огурца тип пола (гинодомный или однодомный) и степень их выраженности оказывают прямое влияние на время сбора урожая, продуктивность и продуктивность. Выражение пола также сыграло жизненно важную роль в производстве семян, а также в развитии новых типов растений. Признаки цветения, такие как номер узла, на котором появляется первый женский цветок, количество дней до открытия первого пестичного цветка и соотношение мужских и женских (♂:♀) цветков (соотношение полов), являются важными признаками для определения скороспелости и урожайности плодов.Экспрессия пола у огурца контролируется тремя генами: F , M и A [31]. Степень экспрессии женских цветков контролируется геном F/f [31, 32]. Локус F определяет количество женского пола ( FF  >  Ff  >  ff ). Генетическое проявление пола у гибрида F ₁ от скрещивания гинекоозных × однодомных регулируется частичным доминированием ([33]; Perl-Treves and Rajagopalan [34], где, как и у гинекологических × субандроэциозных, оно регулируется несколькими генами [35]. одиночный ген с доминантным или неполным доминированием [36], одиночный доминантный ген [8, 37, 38, 39] и олигоген с некоторыми модифицированными генами [40], три основных QTL, обеспечивающих субгинечность у огурцов [41]. Семь гинекологических QTL были обнаружены на хромосомах 5 и 6 в популяции обратного скрещивания [42]. Эти исследования показали, что гиноэозность является важным экономическим признаком, определяющим раннеспелость и урожайность огурца.

2.3 Партенокарпия

Открытие партенокарпии у огурца привело к развитию бессемянных плодов в сочетании с гинекологическим признаком.Гиноция в сочетании с партенокарпией является параметром, связанным с урожайностью и качеством, и представляет собой высокоценную овощную культуру, подходящую для защищенного выращивания, поскольку эти сорта не требуют опыления для завязывания плодов. Плоды тепличных партенокарпических сортов огурцов также мягкие на вкус, бессемянные, с тонкой кожурой, не требующей очистки. Тем не менее, генетика партенокарпии у огурцов недостаточно изучена, что крайне важно для эффективной процедуры селекции. Пайк и Петерсон [43]; Ким и др.[44] и Jat et al. [38] предположили, что за развитие партенокарпических плодов отвечает неполный доминантный ген. Один рецессивный ген отвечает за партенокарпию у огурца [45]. Условия выращивания и эпистатические взаимодействия влияют на признак партенокарпии [46, 47] и два аддитивных доминантных эпистатических основных гена и аддитивные доминантные полигены [35]. Семь QTL для партенокарпии были обнаружены на хромосомах 5 и 7 ( parth5.1 и parth7.1 ) и два на хромосоме 6 ( parth6.1 и партh6.2 ) [48]. Был идентифицирован один главный эффект QTL (часть 2.1), контролирующий партенокарпию [49, 50]. Идентификация QTL является ценным ресурсом для селекционеров огурцов при разработке партенокарпических сортов.

2.4 Признаки плодов

Улучшение характеристик плодов, включая форму, размер и цвет, является важной целью селекции огурцов. Свойства плодов, такие как вес плода, длина, диаметр и количество плодов на растении, напрямую связаны с урожайностью. Другие признаки, такие как индекс формы (длина: диаметр и соотношение длина/стебель), кожица плода (размер шипов, тусклый или однородный цвет плода) и горечь плода определяют рыночную стоимость фруктов, которые важны, в частности, для нарезки огурца [51]. Один рецессивный ген контролирует аромат огурца [52], признаки окраски плодов контролируются двумя основными генами, был идентифицирован один рецессивный ген ( w ), который контролирует белый цвет незрелых плодов [53], один рецессивный ген контролировал наследование количества бета-каротина [54].Зеленый цвет мякоти является одним из наиболее важных и коммерческих признаков плодов огурца, который контролировался основным эффектом QTL [55]. Изогнутые признаки плодов были количественным наследованием, контролируемым множественными генами и основными генами [56]. Двойные сросшиеся плоды контролировались одним рецессивным геном [57]. Два локуса, контролирующих горечь плодов огурца [24, 25, 26]. QTL были также идентифицированы у огурца по нескольким экономическим признакам, включая корешок плода, цвет кожуры, сетку плода, размер плода, размер полости, вариацию толщины мякоти [58], количество плодовых плодолистиков, выражение пола, длину плода, диаметр плода, форму плода, число плодов, устойчивость к мучнистой росе [28, 29].

2.5 Наследование устойчивости к болезням

Некоторые болезни поражают огурцы, что приводит к огромным потерям урожая при производстве. Распространенными болезнями, поражающими огурцы, являются мучнистая роса, ложная мучнистая роса, антракноз, парша, угловатая пятнистость листьев и вирусные заболевания (вирус мозаики огурца (ЦМВ), вирус кольцевой пятнистости папайи, вирус желтой мозаики кабачка). Борьба с этими заболеваниями увеличивает стоимость производства из-за увеличения использования химических веществ для борьбы с болезнями, что также оказывает неблагоприятное воздействие на окружающую среду и экологию.Разработка устойчивых источников и выведение устойчивых сортов являются экономичным, более здоровым и экологически безопасным подходом. Существуют разные подходы к воспитанию устойчивости к разным видам стрессов, включающие как традиционные, так и современные средства. Достижение цели создания устойчивого сорта также требует внимания к устойчивости устойчивости, для чего необходимы знания об устойчивости в отношении наследования, экспрессии и взаимодействия с родственными генами и аспектами окружающей среды.

2.6 Мучнистая роса

Это одно из самых серьезных заболеваний листьев огурцов, но наследование его устойчивости до сих пор остается неясным, что является основным узким местом в разработке улучшенных сортов огурца. Для борьбы с этим заболеванием доступно несколько фунгицидов, но их применение увеличивает нагрузку на окружающую среду и финансовое давление на производителей [59]. Поэтому разработка подходящих генотипов, устойчивых к мучнистой росе, требует особого внимания. Было идентифицировано несколько устойчивых сортов огурцов, устойчивых только к мучнистой росе, таких как PI 250147 [60], S06 [61] и SSSL0.7 [62]. Устойчивость сорта Puerto Rico 37 контролировалась несколькими рецессивными генами [63], устойчивость к PM сорта PI 197087 контролировалась 1–2 мажорными и 1–2 минорными генами [64], одним и двумя рецессивными генами у PI 2008151. и Natsufushinari, соответственно [65], главный рецессивный ген (гены) и доминантный ген (R) и доминантный ген-супрессор (I) в P1212233 и P123514, [66, 67]. Постепенно были идентифицированы генетические локусы, придающие устойчивость к ПМ: pm-1, pm-2, pm-3 и pm-h локусов [60].Доминантно наследуемый ген устойчивости к PM, Pm1.1 , присутствующий в китайской длинной линии Jin5–508, который был картирован. Наиболее устойчивые сорта огурцов становятся восприимчивыми к ТЧ при низких температурах. В совокупности наследование устойчивости огурцов к РМ является сложным и зависит от температуры и региона.

2.7 Ложная мучнистая роса

Понимание наследственности ложной мучнистой росы имеет основополагающее значение для успешных программ селекции огурцов. Устойчивость к ложной мучнистой росе контролируется одним рецессивным геном [68, 69], парой взаимодействующих доминантных и рецессивных генов [70], двумя рецессивными генами у PI 197088 и одним рецессивным геном у ‘Poinsett’ [71], тремя рецессивными генами, dm-1 , dm-2 и dm-3 [72], два неполностью доминантных гена [73], наследование устойчивости к ложной мучнистой росе количественное [24, 25, 26, 74], количество генов, за устойчивость отвечают доминантные, частично доминантные или рецессивные гены [75], множественные рецессивные гены [76]. Образец огурца PI 197087 из Индии и его производные, такие как Gy14, устойчивы к ложной мучнистой росе, вызываемой дм-1. dm-1 , обладающий устойчивостью к СД, был менее эффективен с 2004 г., когда появились новые штаммы возбудителя СД. Различные результаты наследования устойчивости к ложной мучнистой росе могут быть связаны с некоторыми факторами, такими как изменчивость патогенов, факторы окружающей среды (температура, относительная влажность, перемещение инокулята и т. д.), механизм устойчивости и источник устойчивости.Недавно из PI 197088 и PI 330628 были идентифицированы два QTL основного эффекта для устойчивости к штамму DM ( dm4.1 и dm5.2 ). не эффективны; поэтому генетическая устойчивость считается основной линией защиты. Генетический анализ показал, что устойчивость к ЦМВ у огурца наследуется количественно [77], тогда как у Cucumis sativus var. hardwickii (дикий родственник) контролируется одним рецессивным геном [78]. Наследование устойчивости к вирусу желтой мозаики кабачков у огурцов контролируется одним рецессивным геном (2). Гены устойчивости к вирусам картированы на хромосоме 6, в том числе psrv для PSRV, wmv для WMV и cmv6.1 для CMV [77, 79, 80]. Недавно сообщалось о вирусе желтой окраски тыквенной тли (CABYV) в огурцах из Индии [81].

3. Традиционная селекция

3.1 Традиционные цели и достижения селекции

Выведение высокоурожайных сортов с лучшим качеством плодов является основной целью программ селекции огурцов по всему миру.В связи с интрогрессией гинеозных половых форм на фоне различных товарных классов огурца создание сортов с признаками скороспелости наряду с высоким соотношением женских и мужских цветков также является важной задачей селекции огурцов. Таким образом, был достигнут быстрый прогресс в разработке гинеокарпических и партенокарпических линий/сортов огурцов, пригодных для выращивания в теплицах. Селекционеры огурцов разработали несколько генетических подвоев для устойчивости к вредителям и болезням. Интрогрессия гена устойчивости к вредителям и болезням из доступных источников должна стать основной целью большинства программ селекции огурцов в будущем для создания сортов с множественной устойчивостью к болезням (MDR), включая устойчивость к вирусам. В зависимости от региональных предпочтений потребителей у огурца отобраны различные качественные характеристики плодов. Эти качественные признаки включают размер плода, форму (длину и диаметр), цвет (светло-зеленый, темно-зеленый), срок годности, наличие семян и пищевую ценность.Селекционеры огурцов объединили несколько генов экспрессии пола и качества плодов для получения желаемых генотипов. Многие гибриды огурцов для засолки были выведены путем скрещивания гинодомных линий с однодомными. Эти гибриды преимущественно гинеозные по своей природе, которые дают пыльцу для завязывания плодов, что увеличивает общий урожай маринованных огурцов. Методы селекции для достижения этих целей у разных селекционеров различаются, как и его / ее определение качественных плодов. Гинекологический пол также сочетается с партенокарным признаком завязывания плодов без пыльцы, особенно при выращивании в теплицах, поскольку он устраняет необходимость в опылении и дает плоды высшего качества.Гинозное половое выражение коммерчески использовалось для производства гибридных семян, поскольку женские растения не дают мужских цветков. В последнее время селекционеры огурцов заинтересовались созданием линий, богатых каротином (желтый огурец). С использованием гетерозисной селекции было выведено несколько сортов огурцов с ранними признаками, высокой урожайностью и устойчивостью к болезням. Наиболее часто используемые методы селекции для улучшения огурца — это инбридинг, отбор отдельных растений из сегрегирующих популяций, гетерозисная селекция и в настоящее время селекция с помощью маркеров (MAS).Наиболее распространенной процедурой разведения огурцов является отбор местного сорта. Несколько гибридов F ₁ были выведены для огурца как в государственном, так и в частном секторе путем гибридизации по всему миру. Огурцы легко выращиваются, индетерминантные типы растений дают множество крупных цветов для работы в течение длительного периода времени, при этом наблюдаются большие вариации количественных и качественных признаков. Использование в селекционной программе гиноезных линий в качестве одной из родительских позволило увеличить площади выращивания гибридов.Недавние исследования картирования QTL и клонирования многих количественных признаков у огурцов представят полную картину генетической архитектуры этих признаков. Идентификация молекулярных маркеров (SNP и SSR) признаков скороспелости, урожайности и качества будет непосредственно полезна при отборе генома для ускорения селекции огурцов в различных рыночных классах. Клонирование QTL и полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) для важных количественных признаков будут более инновационными и ориентированными на будущее для селекции огурцов по конкретным признакам.

3.2 Методы селекции

Для генетического улучшения огурцов использовались несколько методов селекции в зависимости от конкретных целей селекции. Отбор одного растения, метод происхождения одного семени, массовый отбор, простое обратное скрещивание, племенной отбор, гибридизация, использование наследования пола и химических веществ в селекции, а также улучшение популяции и выделение инбредных линий являются наиболее распространенными методами. В последнее время для улучшения количественных и качественных признаков в различных рыночных классах огурцов были разработаны линии, полученные с помощью маркерной селекции.Простое обратное скрещивание весьма полезно для переноса признаков, управляемых отдельными генами, например. устойчивость к болезням или качественные признаки от донорских линий к более стабильным рекуррентным родителям. Часто для восстановления желаемых генотипов (рекуррентный родитель + дополнительный признак) требуется шесть поколений селекции и обратного скрещивания с рекуррентным родителем. Метод односеменного происхождения полезен для развития инбредных линий путем самоопыления. При химической селекции гинекологические линии обрабатывают нитратом серебра/тиосульфатом серебра, чтобы вызвать цветки-гермафродиты для опыления. Метод улучшения популяции основан на повторяющемся отборе и направлен на долгосрочное улучшение признаков с низкой или умеренной наследуемостью. Использование гибридной силы огурца желательно из-за высокого гетерозиса по скороспелости, урожайности и устойчивости к болезням. Гетерозисная селекция может использовать генетическое разнообразие, присутствующее в огурцах, для различных характеристик роста и урожайности. В странах Запада почти 90% площадей огурца приходится на гибриды F ₁ .

3.3 Гетерозисная селекция

Огурец – однодомная и перекрестно опыляемая культура, есть большие возможности для эксплуатации гетерозиса.Высокий уровень гибридной силы может быть получен при участии разнородных родителей. Было проведено несколько исследований для определения наилучшей гетерозисной комбинации скороспелости, урожайности и качества огурца. Заметный гетерозис наблюдался по сравнению с лучшим родителем и верхним родителем по многим экономическим признакам, таким как количество узлов первых женских цветков, количество плодов на растении, количество дней до завязывания плодов, количество дней до первого сбора плодов, урожайность с растения [82, 83, 84, 85]. , 86, 87, 88, 89]. Также сообщалось о значительном гетерозисе признаков скороспелости при использовании гинециальных линий [82, 83, 90] и признаков качества [88].Гибридные комбинации гинодомные х гинекоозные и гинодомные х однодомные показали максимальный гетерозис, за которым следовали однодомные х однодомные гибриды по скороспелости и урожайности с растения [83, 90]. Таким образом, урожайность огурца может быть увеличена за счет использования гиноезной линии в качестве одного из родителей в будущей программе разведения. Следовательно, селекционер должен сосредоточиться в основном на количестве плодов, а не на их размере, чтобы увеличить урожайность огурца.

3.4 Ограничения традиционной селекции

Традиционная селекция имеет основные ограничения своей зависимости только от отбора признаков, основанных на морфологических маркерах (признаки листьев, признаки цветения, включая соотношение полов, цвет плодов, размер плодов, форму и т. д.).) из сегрегирующей популяции. Традиционная селекция эффективно использовалась для улучшения качественных признаков. Такие признаки, как огурцы, содержащие бета-каротин (связанные с оранжевой мякотью) и партенокарпия (связанные с отсутствием косточек), являются классическими примерами селекции с использованием морфологических маркеров. Традиционная селекция также использовалась для значительных изменений важных количественных признаков, включая скороспелость, размер плодов, отсутствие горечи и урожайность плодов. Дальнейшее генетическое улучшение количественных признаков с использованием традиционных стратегий потребует больше времени.Например, отбор на партенокарпию будет затруднен по внешнему виду, как это делалось в прошлом. Довольно просто выбрать генотипы огурцов, содержащие высокое содержание бета-каротина, из сегрегирующей популяции, но трудно различить уровни каротина по цвету.

Наиболее эффективным методом выбора признака с множественными аллелями является использование нескольких маркеров для идентификации большинства аллелей. Особенно это касается урожая огурцов, для оценки которого требуется большое пространство. Однако фенотипические маркеры будут иметь внутренний недостаток, если на признак влияют факторы окружающей среды. Создание линий устойчивости к болезням часто является сложной задачей для посевов огурцов. Многие признаки устойчивости к болезням являются количественными; их экспрессия зависит от факторов окружающей среды и требует сложной процедуры инокуляции. Вирус огуречной мозаики, ложная мучнистая роса и мучнистая роса являются хорошими примерами болезней, при которых выведение новых сортов с высоким уровнем устойчивости до сих пор оказывалось затруднительным.Для борьбы с этими болезнями следует использовать стратегию устойчивости растений-хозяев. Для этих болезней было идентифицировано несколько устойчивых источников [91] по всему миру, но эти генотипы не выдерживают высокого давления болезни в различных местах.

3.5 Обоснование молекулярной селекции

Молекулярные маркеры могут преодолеть ограничения традиционных методов селекции, поскольку они неразрушающие, устраняют экологические вариации, связанные с устойчивостью к болезням, и могут оцениваться одновременно по нескольким признакам. Однако молекулярное разведение требует развития сегрегирующих популяций по интересующим признакам, и признак должен быть правильно идентифицирован во время идентификации маркера. В последнее время благодаря передовым технологиям секвенирования генома популярность приобрели широкогеномные исследования ассоциаций (GWAS) или картирование неравновесия по сцеплению (LD), которые представляют собой мощный и альтернативный подход к генетическому картированию для идентификации и анализа важных областей QTL, которые содержат гены-кандидаты интерес к растениям [92].Когда GWAS выполняется на большом наборе панелей разнообразия, он обеспечивает картирование связанных вариантов признаков с более высоким разрешением, поскольку он использует исторические события рекомбинации. Исследование GWAS идентифицирует геномные области, содержащие локусы, контролирующие различные признаки. Данные секвенирования помогут в разработке желаемых генотипов в виде сортов, которые помогут фермерам получать более высокую отдачу от своих инвестиций. Потенциал молекулярной селекции для экономии денег заключается в их долгосрочном использовании в сочетании с несколькими маркерами для самых разных признаков; это позволит селекционерам огурцов отобрать несколько признаков из больших популяций.

4. Заключение

Классическая генетика и традиционные методы селекции внесли большой вклад в лучшее понимание и генетическое улучшение урожая огурцов по ряду качественных и количественных признаков, понимание филогенетических отношений и таксономии. Используя традиционные методы селекции, селекционеры огурцов определили ряд генов, связанных с экономическими признаками, и использовали эту информацию для создания ранних и высокоурожайных сортов. Выдвижение некоторых количественных признаков с использованием традиционной методологии является сложным и трудоемким процессом.Таким образом, технология молекулярных маркеров позволяет преодолеть препятствия, связанные с традиционной селекцией. Молекулярная селекция сыграла значительную роль в лучшем понимании генетики огурцов и была непосредственно ответственна за некоторые улучшения, достигнутые в современных сортах огурцов в различных классах рынка. Классические селекционеры говорили: «Все возможно с использованием традиционных подходов; просто мир недостаточно велик, чтобы вместить популяции, необходимые для поиска вариаций, необходимых для некоторых признаков.По мере того, как мы продвигаемся вперед в области молекулярной селекции огурцов, важно, чтобы мы понимали необходимость сохранения традиционных программ селекции и чтобы набор навыков, необходимых для классической селекции, не был утерян.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

1. Введение

Два вирусных заболевания, поражающих Leporidae, перечислены в Руководстве по наземным животным Всемирной организации здравоохранения животных: миксоматоз и геморрагическая болезнь кроликов.И то, и другое имеет большое значение для диких и домашних кроликов и зайцев, нанося серьезный ущерб окружающей среде со значительными финансовыми последствиями. Это также находит отражение в количестве научной литературы, посвященной этим заболеваниям и вирусам, вызывающим их, а именно вирусу миксомы (MYXV) и вирусу геморрагической болезни кроликов (RHDV). MYXV и RHDV принадлежат к двум вирусным семействам Poxviridae и Caliciviridae соответственно. Эти семейства вирусов включают ряд других вирусов, имеющих значение для зайцеобразных.В первом разделе этой главы мы рассматриваем молекулярную биологию вирусов из этих двух семейств вирусов. Зайцеобразные также подвержены более широкому спектру вирусных инфекций, которые мы опишем в части II этой главы.

3.

Существуют две опустошительные болезни, вызываемые зайцеобразными. Геморрагическая болезнь кроликов (RHD) и синдром европейского бурого зайца (EBHS), как следует из названий, считались видоспецифичными.Однако последние данные требуют пересмотра этой точки зрения. Оба заболевания были эндемичными в Европе с момента первых описаний в 1980-х годах (обзор в [77, 78]). Из-за экономической и экологической важности европейского кролика RHD был предметом большинства исследований. Но недавнее появление лаговируса с более широким кругом хозяев, связанные с этим экологические проблемы и достижения в области молекулярно-биологических инструментов, доступных для изучения этих заболеваний, меняют эту динамику.

3.1 Вирус геморрагической болезни кроликов (RHDV)

3.1.1 RHDV GI.1

Геморрагическая болезнь кроликов впервые была обнаружена в Китае в 1984 г. у ангорских кроликов, импортированных из Европы, что, по-видимому, было появлением новой высоковирулентной болезни, которая быстро убил тысячи домашних кроликов. Болезнь распространилась по Китаю и Корее и достигла Европы (Италии) в 1986 г. (обзоры в [77, 79]).

Первое сообщение о случаях в Испании, родине европейского кролика, было в 1988 г. [80] у домашних кроликов, и болезнь вскоре вызвала эпизоотические эпизоды у диких кроликов [81].Сокращение популяции диких кроликов было серьезным [82], и это оказало прямое влияние на специализированные виды хищников, такие как находящиеся под угрозой исчезновения иберийская рысь ( Lynx pardinus ) или испанский могильник ( A. adalberti ) [52, 83]. Влияние болезни на популяции кроликов в Европе было таким, что были проведены испытания для использования болезни в качестве дополнительной меры биологической борьбы с кроличьим вредителем в Австралии, которая выздоравливала после первоначального успеха борьбы с миксоматозом [84]. .

RHDV, этиологический агент RHD, оставался эндемичным в Европе более 30 лет с преобладанием одного серотипа (RHDV GI.1) до 2010 года. Кролики, пережившие инфекцию, вырабатывают сильный длительный иммунитет с обнаруживаемыми антителами против RHDV в сыворотка. Молодые кролики не восприимчивы к заболеванию, вызываемому RHDV GI.1, однако они могут быть инфицированы, и механизм резистентности до конца не изучен. Экономические последствия болезни в секторе кролиководства значительны.Были разработаны инактивированные вакцины (например, гомогенаты печени, инфицированные RHDV, обработанные β-пропиолактоном) [85, 86], и они доказали свою эффективность в снижении смертности в коммерческих крольчатниках, хотя из-за естественного резервуара RHDV у диких кроликов необходимо последовательно поддерживать меры контроля. Что касается контроля, важно указать, что непосредственный контакт между кроликами [87] и фомитами (зараженная пища и подстилка) играет важную роль во вспышках на фермах. При естественных инфекциях фекально-оральный путь считается предпочтительным путем передачи вируса [88] (см. обзор [78]).В дикой природе трупы кроликов также являются основным источником вируса, распространению которого способствуют хищники и насекомые, питающиеся падалью [89, 90].

3.1.2 RHDV GI.2

В 2010 г. выявлены атипичные вспышки RHD. Вирус, ответственный за эти вспышки, был первоначально обнаружен во Франции [91] и назван новым вариантом RHDV, где вспышки, поражающие вакцинированных кроликов, вызывали беспокойство. Позднее этот вариант был обнаружен в Испании, где изоляты вируса использовались для выявления восприимчивости молодых кроликов, а также для демонстрации основных антигенных различий в отношении RHDV GI.1 и наличие вируса в кишечнике [92]. Другим существенным отличием заболевания, вызываемого этим вирусом, по сравнению с классическим RHDV GI.1 является уровень летальности. RHDV GI.1 обычно показывает уровень смертности 80–90% у взрослых кроликов [93] без смертности в наборах, в то время как вариант RHDV показал примерно 10% у взрослых кроликов и до 50% в наборах. Термины вариант и RHDVb впервые были использованы для идентификации этого вируса [91, 92]. В последующих публикациях использовались термины RHDVb и RHDV2.Чтобы избежать путаницы и внести порядок в систему номенклатуры лаговирусов, Le Pendu et al. предложили новую схему, в которой RHDVb/RHDV2 был назван Lagovirus europaeus/GI.2 /(GI.2), а RHDV был назван Lagovirus europaeus/GI.1 /, (GI.1). Предложенная система номенклатуры и классификации позволяет систематизировать определение с использованием филогенеза и генетических расстояний для определения изолятов, включает патогенные и непатогенные лаговирусы и позволяет включать еще не идентифицированные вирусные последовательности [94].

Учитывая новые характеристики RHDV GI.2, неудивительно, что вирус продолжал распространяться. К 2013 г. вирус был обнаружен на всей территории Франции, Испании, Португалии и присутствовал в Италии [95, 96, 97]. RHDV GI.2 и с тех пор распространился до масштабов пандемии и был обнаружен на континентах Европы, Африки, Азии, Австралии и Северной Америки.

Отсутствие полной перекрестной защиты, вызванное предшествующим контактом со штаммами RHDV GI.1, способствовало быстрому распространению RHDVGI.2 в Европе [98, 99], что привело к высокой смертности среди диких популяций вскоре после его появления. Поэтому были произведены вакцины на основе RHDVGI.2, содержащие инактивированные экстракты печени, для помощи в борьбе с болезнью у домашних кроликов.

Наблюдение частичной защиты между GI.1 и GI.2 было подтверждено данными об инфекциях RHDV GI.2 в Австралии, где смертность была обнаружена у домашних вакцинированных RHDV животных [100], что способствовало его быстрому распространению в дикой природе [101]. ].В настоящее время представляется, что RHDV GI.2 стал преобладающим RHDV на Пиренейском полуострове [102, 103], а также на материковой части Австралии, заменив эндемичные штаммы RHDV GI.1 [100]. Хотя это может привести к экологическим и экономическим преимуществам в Австралии [104], появление этого вируса в Европе представляет собой важную проблему для сохранения европейского кролика, особенно в небольших популяциях [105, 106], а также для сохранения зависящих от него хищников [105, 106]. 107].

3.2 Калицивирус кролика (RCV) GI.3 и GI.4

Присутствие антител против RHDV в популяции кроликов указывает на циркуляцию RHDV. Однако в 1995 г. антитела, реагирующие с RHDV, были обнаружены у кроликов, у которых не было клинических признаков инфекции RHDV [108]. Этот вывод был подтвержден идентификацией непатогенного калицивируса (называемого калицивирусом кролика — RCV) [109]. Впоследствии RCV были обнаружены в Австралии [110] и Франции [111]. Лаговирусы RCV генетически родственны RHDV, хотя демонстрируют различный клеточный тропизм и являются апатогенными.В то время как органами-мишенями RHDV являются легкие, печень и селезенка, RCV был обнаружен преимущественно в кишечнике. Утверждается, что присутствие RCV оказывает защитное действие на популяции кроликов, сталкивающихся со вспышками RHDV, и могло быть определяющим фактором скорости распространения RHDV в Европе и Австралии [112], однако уровни защиты различаются и, вероятно, зависят от на различные уровни перекрестной реактивности и время заражения [111, 113].

3.3 Вирус синдрома европейского бурого зайца (EBHSV) GII.1 и калицивирус зайца (HaCV) GII.2

Вирус европейского синдрома бурого зайца (EBHSV) GII.1 был обнаружен во многих странах Европы и Аргентине, появившись в Швеции в начале 1980-х годов и в Дании в 1982 году (рассмотрено в [114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121], хотя ретроспективные исследования показали, что вирус присутствовал и раньше [122, 123].ЭБВГ вызывает заболевание у зайцев-русаков ( Lepus europaeus ) и зайцев-беляков ( Lepus timidus ) [114, 124], в то время как восточный кролик ( Sylvilagus floridanus ) также восприимчив [125], но не европейский кролик ( Orytolagus cuniculus ) [126].Симптомы заболевания аналогичны симптомам, наблюдаемым при RHDV, в первую очередь заболевание протекает остро и может проявляться респираторными и нервными симптомами и носовым кровотечением [127], в печени выявляется тяжелый некротизирующий гепатит, хотя также сообщалось о различиях между заболеваниями [128]. Подобно RHDV GI.1, EBHSV не поражает молодых зайцев [121, 124].

Идентификация калицивирусов зайца (HaCV) GII.2, связанных с EBHSV, также показала большое разнообразие и сложность, которые существуют для этих родов вирусов [129, 130, 131, 132].HaCV был обнаружен в двенадцатиперстной кишке или фекалиях здоровых зайцев в Италии, Франции, Австрии, Германии и Австралии (также слабо обнаружен в печени) [129, 130, 131, 132, 133]. Вирус считается непатогенным на основании состояния здоровья животных, от которых были получены образцы, и органа-мишени, однако фенотипы вирулентности не опубликованы. Расширение наших знаний об этих вирусах, несомненно, поможет понять их роль в защите популяций зайцеобразных от патогенных вирусов и в появлении новых вирусов в результате рекомбинации.

Как и лаговирусы, EBHSV и HaCV имеют ту же организацию генома (рис. 4) и морфологию вирионов, что и RHDV, однако после филогенетического анализа они образуют отдельные генетические группы и антигенно отличаются от RHDV [123, 134, 135, 136, 137]. RHDV GI.2 также был обнаружен как высоковирулентный у разных видов зайцев [138] либо в результате распространения от ближайших популяций кроликов, либо в результате передачи от зайца к зайцу. Эти результаты подчеркнули необходимость изучения межвидовых вирусных инфекций у зайцеобразных [130, 132].Недавнее обнаружение рекомбинантных вирусов RHDV GI.2 и EBHSV GII.1 [139] подчеркивает возможность эволюции зайцеобразных и указывает на важность постоянной бдительности для защиты уязвимых видов зайцеобразных.

3.4 Вирион, организация генома

Лаговирусы представляют собой безоболочечные икосаэдрические одноцепочечные РНК-вирусы с положительным смыслом [87, 140, 141]. Помимо морфологических особенностей вирионов, все лаговирусы имеют общую организацию генома, имеют консервативные геномные особенности и экспрессируют две ORF, как показано на рисунке 2.

Рисунок 2.

w3.org/2001/XMLSchema-instance»> Схематическое изображение генома зайцеобразных и основных геномных признаков, общих для всех зайцеобразных. Фрагменты выравнивания последовательностей из указанных изолятов показывают: 5′-нетранслируемую область (NTR), сайт начала трансляции полипротеина, сайты инициации субгеномной РНК, центральную последовательность сайта терминации вышестоящего сайта связывания рибосом (TURBS) и сайт терминации/повторной инициации, необходимый для трансляции VP10 [142].

ORF 1 экспрессирует полипротеин, который процессируется с образованием неструктурных зрелых пептидов и VP60, основного структурного капсидного белка (также называемого в литературе VP1).ORF 2 кодирует второстепенный структурный белок VP10, также называемый VP2. Лаговирусы также имеют общие консервативные сайты процессинга полипротеинов (рис. 3) и. Расшифруйте субгеномную РНК, связанную с VPg, из которой экспрессируются VP60 и VP10. ORF для VP60 и VP10 перекрываются, и экспрессия VP10 происходит посредством механизма терминации/повторной инициации (рис. 3).

Рис. 3.

Схематическое изображение консервативных мотивов, расположенных в полипротеине, кодируемом ORF 1, и выравнивание аминокислот, показывающее консервативные сайты протеолитического процессинга среди лаговирусов.

RHDV GI.1 представляет собой наиболее подробно охарактеризованный лаговирус и поэтому является эталонным вирусом для этого рода. Длина генома вируса составляет приблизительно 7,4 т.п.н. Вирусные частицы имеют небольшой размер (диаметр 35–40 нм) и содержат геномную (гРНК) и субгеномную РНК (згРНК), которая коллинеарна 3′-концу геномной РНК [143, 144, 145]. Обе РНК полиаденилированы на 3′-конце. В своей 5′-области они ковалентно связаны с белком VPg (связанным с геномом вируса) [146] (рис. 2), который может действовать как замена кэпа во время трансляции RHDV [147].Геномная РНК содержит две открытые рамки считывания (ORF): ORF1 кодирует полипротеин массой 257 кДа, который после посттрансляционного расщепления вирусной протеазой приводит к 7 неструктурным белкам (p16, p23, p37 (NTPase), p29, p13 (VPg), p15 (протеаза), p58 (РНК-зависимая РНК-полимераза) (также называемые неструктурными белками (NS) 1–7) и главный белок капсида (VP60) [144, 145, 148]. последовательности, кодирующие ORF1 и ORF2, перекрываются на 20 нуклеотидов. Рамка считывания ORF2 смещена по отношению к ORF1 и кодирует минорный капсидный белок (VP10), который составляет 10–12 кДа.VP10 (также называемый VP2 в некоторых публикациях в соответствии с номенклатурой норовирусов) транслируется с помощью механизма терминации/повторной инициации [142], зависящего от элемента TURBS (сайт терминации вышестоящего сайта связывания рибосомы) (коровая последовательность GUGGGA), расположенного внутри кодирующей последовательности VP60. [149]. Роль белка VP10 связывают с регуляцией вирусной репликации и стимулированием апоптоза для высвобождения вирионов из инфицированных клеток [145, 150]. Биологическая роль неструктурных белков изучалась с помощью анализа последовательностей и функциональных исследований, а также на основе предыдущих знаний, полученных от членов семейства Picornaviridae [143, 145, 151].Четыре неструктурных белка имеют четко определенные функции, а именно РНК-хеликаза (p37) [151], белок, связанный с геномом вируса VPg (p13), 3C-подобная протеаза (p15 или Pro) и РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp). [146, 152, 153] (рис. 3). Было показано, что RdRp катализирует уридилирование VPg [146, 154]. Каталитический сайт протеазы RHDV (Pro) [155] был картирован с помощью сайт-направленного мутагенеза [155], и были идентифицированы вирусные пептиды-мишени [156]. RdRp функционирует при репликации вирусной РНК и уридилирования VPg [154].В то время как предшественник (Pro-Pol) проявляет активность, обработанная зрелая форма проявляет повышенную способность к функции полимеразы [154]. Экспрессия рекомбинантного RHDV RdRp в трансфицированных клетках RK13 приводит к реорганизации мембран Гольджи [157]. Кристаллическая структура этого белка была выяснена [158], что позволило понять структурно-функциональный механизм, участвующий в репликации вируса. Недавно была установлена ​​внутриклеточная локализация неструктурных белков RHDV p16, p23 и p29 [157], однако их функции до сих пор неизвестны.

3,5 VP60 основной структурный компонент вириона

Наиболее хорошо охарактеризованным из белков RHDV является VP60. Он является основным структурным компонентом вирионов, ответственным за связывание с рецептором, обладает высокой иммуногенностью и является мишенью для нейтрализующих антител. VP60 экспрессируется из субгеномной РНК в инфицированных клетках, обеспечивая достаточный уровень для сборки вириона. Высокие уровни sgRNA делают ее хорошей мишенью для диагностической RT-PCR, а ее вариабельность из-за иммунного отбора подходит для последующего анализа последовательности.Данные о последовательности частичных и полноразмерных фрагментов РНК, кодирующей VP60, послужили основой для сравнительного анализа последовательностей.

Хотя RHDV не культивируется in vitro , экспрессия VP60 и образование вирусоподобных частиц (VLP) делает производство рекомбинантных вакцин привлекательной альтернативой и этически приемлемой заменой традиционным инактивированным вакцинам, которые получают из инфицированных гомогенатов печени.

ВПЧ использовались для структурной характеристики этого белка, определения его антигенности и изучения связывания с рецепторами [159, 160, 161, 162, 163, 164]. Кроме того, очищенные вирусные частицы дикого типа использовались для определения атомной модели с помощью криоэлектронной микроскопии [165].

Изоляты RHDV GI.2 антигенно отличаются от RHDV GI.1 и в различной степени агглютинируют эритроциты человека [92, 166, 167, 168]. Гемагглютинация зависит от присутствия антигенов группы крови ABH, и эти молекулы были предложены в качестве рецепторных компонентов пути связывания [169]. Действительно, видоспецифичность этих молекул может объяснить восприимчивость к различным лаговирусам [170].

Вирионы состоят из 90 димеров VP60, образующих на поверхности вирионов 32 чашеобразных углубления (отсюда и название Calici- от латинского calix или чашка) [165, 171]. Каждый мономер VP60 состоит из оболочечного (S) домена, который скрыт внутри структуры вириона и окружен N-концевым плечом (NTA) и так называемым шарниром, который связывает S-домен с выступающим (P) доменом. которые соответствуют С-концевому участку и экспонируются на поверхности вириона [166, 172, 173, 174]. Шарнир дает доменам P и S определенную степень гибкости в их трехмерном расположении [165]. Домен P содержит детерминанты для взаимодействия вирус-рецептор-хозяин и антигенного разнообразия [165, 166]. Кроме того, эта область может быть дополнительно подразделена на субдомены P1 и P2, P2 содержит гипервариабельную область белка, которая позволяет проводить отбор вариантов, которые могут ускользнуть от обнаружения иммунной системой или нейтрализации антителами.

Выраженные антигенные различия наблюдаются между RHDV GI.1 и RHDV GI.2 [168], объясняют отсутствие эффективной защиты от RHDV GI.2, обеспечиваемой инактивированными вакцинами RHDV GI.1 [91, 92], а также способность RHDV GI.2 преодолевать иммунные реакции. от естественных инфекций RHDV GI.1 [101]. С момента появления RHDV GI.2 разработка диагностических инструментов была очень важной проблемой, и были усовершенствованы различные методы и методологии для специфического выявления RHDV GI.2 [168, 175, 176, 177].

3.6 Эволюция: генотипы, антигенные варианты

Хотя воспринимается как новый вирус (GI. 1) при первоначальной вспышке 1984 г. ретроспективный серологический анализ [108] и анализ последовательности [178, 179, 180, 181] поставили под сомнение это предположение. Анализ молекулярных часов предполагает, что вирус появился до того, как был официально обнаружен [182]. Эти исследования подтверждают теорию о том, что RHDV или подобные вирусы существовали в менее вирулентных формах или оставались незамеченными и циркулировали в популяции кроликов задолго до того, как RHDV стал серьезной проблемой [183]. Возникли ли GI.1 и GI.2 из непатогенных вирусов, в результате событий рекомбинации или в результате скачков между видами, еще предстоит определить [184, 185, 186].

Генетическое разнообразие патогенных изолятов RHDV было предметом интенсивных исследований, при этом капсидный белок (частичный или полный) был основной целью. Недавние достижения в методах секвенирования позволили провести полный геномный анализ в ретроспективных исследованиях и продемонстрировать важность анализа полных геномов [187, 188].

Исследования эволюции RHDV GI.1 в Европе показали низкий уровень изменчивости последовательностей [183, 189] в годы после его появления, хотя было возможно определить отдельные филогенетические группы.За 12 лет после появления RHDV GI.1 во Франции было идентифицировано шесть геногрупп [190, 191] (теперь называемых GI.1a-d). Геногруппа 6 или RHDVa (GI.1a) представляет собой антигенный вариант, впервые выделенный в Италии [192]. Несмотря на то, что они антигенно различны, а сходство последовательностей в гене VP60 составляет 93%, вакцины на основе GI.1 обеспечивают защиту от этого высокопатогенного вируса [191, 192].

Развитие RHDV в Испании шло по иному пути, чем в остальной Европе. Только штаммы GI.1d (ранее геногруппа 1) были обнаружены в образцах, собранных в период с 1988 по 2010 год.Это может быть связано с меньшим количеством проанализированных образцов, однако, в отличие от остальной Европы, штаммы GI.1 все еще обнаруживались на Пиренейском полуострове в 2010 г. RHDVa был обнаружен один раз в Испании у домашних кроликов [193], но по-видимому, не получил широкого распространения и не был обнаружен у диких кроликов. В Австралии чешский штамм V-351 (RHDV GI.1) сбежал из испытательных лабораторий в 1995 г. Последовательность вируса, циркулирующего в Австралии, мало изменилась в первые годы после его побега [194], однако изучение последовательностей RHDV, охватывающих последующие 16 лет выявили его эволюционную тенденцию на этом континенте.Несмотря на более чем 3500 независимых выпусков за это время, положительный отбор предполагает эволюцию штаммов, способных превзойти свежевыпущенные штаммы и распространяться в присутствии непатогенного калицивируса кролика (RCV)-A1 (также GI.4a) [195]. Чтобы более эффективно конкурировать с присутствием RCV-A1, в 2014 г. был выпущен антигенный вариант RHDVa-K5 (GI.1a-K5). эффективная передача, иммунологический статус существующей популяции, ландшафт и погода среди прочего.

Филогенетический анализ показал, что RHDV GI.2 генетически отдален от RHDV GI.1 и более тесно связан с апатогенными вирусами RCV [91, 92]. Происхождение RHDV GI.2 неясно и не может быть объяснено генетической эволюцией из ранее описанных лаговирусов или рекомбинацией существующих штаммов [197, 198]. Сильверио и его коллеги [197], используя анализ последовательностей и среднюю скорость замещения, оценили наличие общего предка для GI.2 всего за несколько лет до его первого обнаружения [197].Экспериментальные инфекции показали, что RHDV GI.2 приобрел вирулентность, показывая более высокие показатели смертности как у взрослых особей, так и у котят [98, 199], чем штаммы, полученные в 2011 или 2012 году вскоре после его появления [98, 199]. Это может указывать на эволюционную тенденцию вируса, действительно, Капуччи и его коллеги (2017) [199] предположили, что это может быть похоже на то, что произошло со штаммами RHDV GI.1 в Австралии [196], где RHDV GI.2 эволюционировал в своем естественные хозяева, и с момента их появления в 2010 г. давление отбора могло благоприятствовать штаммам с более высокой патогенностью.

3.7 Рекомбинация и лаговирусы

Рекомбинация, наряду с мутацией, является важным механизмом эволюции РНК-вирусов, поскольку она использует существующее генетическое разнообразие для создания новых геномных комбинаций. Новые геномы вируса RHDV, возникающие в результате естественной рекомбинации существующих штаммов, были обнаружены в изолятах RHDV [200, 201, 202, 203, 204]. Недавний геномный анализ показывает, что эти события происходят чаще, чем предполагалось ранее [200]. а в связи с высокой частотой встречаемости [195, 197, 200, 201, 202, 203, 205] это может указывать на важную роль в их происхождении и возникновении патогенности.Действительно, Сильверио и его коллеги [197] указали, что возникновение рекомбинации согласуется с обеими теориями возникновения патогенности у лаговирусов, предлагаемыми в настоящее время: (1) эволюция из ранее существовавшего непатогенного вируса, который приобрел патогенность, или (2) после видовой скачок [198]. Особенно в случае очень частых событий рекомбинации, наблюдаемых для нового RHDVGI.2, и его способности пересекать видовые границы [99, 138, 206, 207, 208]. Это также было поддержано Lopes и коллегами [187], которые рассказали об обнаружении рекомбинантного RHDVGI. 2 у пиренейского зайца с видовым прыжком [187].

Количество наблюдаемых комбинаций геномов поражает и раскрывает сложную картину. Как эти события формируют распространение и патогенность RHDV, еще предстоит определить.

В последние годы были идентифицированы случаи рекомбинации в различных регионах генома RHDV. Существование рекомбинантных RHDV, содержащих структурные гены RHDV GI.1 и неструктурные гены, принадлежащие непатогенному лаговирусу (GI.4) были идентифицированы [202]. В некоторых случаях рекомбинация происходила внутри неструктурной области [187]. Были идентифицированы два типа рекомбинантных штаммов RHDV GI.2, оба со своими структурными белками VP60 и VP10, происходящими из GI.2, в то время как их неструктурные белки произошли от GI.1 или непатогенных штаммов (GI.4) [103]. , 187, 197].

Сообщалось о рекомбинации в геномах Iberian GI.2 с точкой разрыва на границе RdRp/VP60 (рис. 4) внутри ORF1.Эта контрольная точка была связана с несколькими независимыми событиями рекомбинации с участием непатогенных штаммов, GI. 1 и/или GI.2, приводящих к различным геномным комбинациям, которые сохранялись в популяциях португальских диких кроликов [187, 197], и рекомбинантных штаммах, обнаруженных на Азорских островах. и Австралии [103, 202, 209]. Гомология между субгеномной РНК (кодирует структурные гены) и 3′-концом геномной РНК (кодирует неструктурные и структурные гены) создает горячую точку рекомбинации на стыке между неструктурными и структурными генами [200, 202].Silverio и коллеги [197] идентифицировали новые рекомбинанты RHDVGI.2 с точкой разрыва рекомбинации, расположенной вблизи границы p16-p23 (NS1/NS2) (нуклеотидные положения 355–471) [197]. Кроме того, они обнаружили наличие тройных рекомбинантов, состоящих из неструктурного белка NS1, подобного непатогенному лаговирусу, основы GI.1b для остальных неструктурных белков и GI.2 в качестве донора для структурного белка. Мутации в последовательностях NS1 считаются фактором повышенной вирулентности желудочно-кишечного тракта.1 изолят [196].

Рисунок 4.

Схематическая диаграмма рекомбинантных геномов зайцеобразных. В показанном примере рекомбинантный Lagovirus europaeus/GI.1P-GI.2 указывает на рекомбинацию, обнаруженную между штаммами GI.1 и G2; P обозначает полимеразу.

3.8 Межвидовые инфекции лаговирусов у зайцеобразных

До появления RHDV GI.2 лаговирусы считались видоспецифичными, RHDV был специфичен для европейского кролика, а EBHSV был специфичен для европейского зайца-русака [126].Однако сообщалось о росте числа инфекций RHDVGI.2 у разных видов кроликов и зайцев, что ставит под сомнение эту четкую дифференциацию. Первоначально считавшиеся временными побочными явлениями, более широкое распространение инфекции GI.2 у ряда видов зайцев вызвало опасения, что этот вирус обладает более широким видовым тропизмом. Первое обнаружение произошло у 7 капских зайцев ( Lepus capensis var. mediterraneus) с поражениями, соответствующими тем, которые наблюдаются при RHD-инфекциях [99].Это исследование впервые продемонстрировало, что видов Lepus показали чувствительность к RHDV GI.2 и явную разницу в отношении восприимчивости к RHDV GI.1 у этого вида, учитывая, что RHDV GI.1 ранее был эндемичным у кроликов в в одном и том же географическом районе в течение 20 лет [99]. Впоследствии RHDV GI.2 был определен как причина гибели итальянского зайца в неволе ( Lepus corsicanus ). У этого вида вирулентность была более ограниченной: препарат заражал только одного зайца [206].Веларде и др. [138] описали первые инфекции RHDV GI.2 у диких европейских зайцев-русаков ( Lepus europaeus ), обнаруженные в Италии (n=1) и Испании (n=2). Серологические данные от диких зайцев, представленные в этом исследовании, подтвердили вывод о том, что это были спорадические инфекции. Однако обнаруженные во Франции широко распространенные инфекции [210] показали, что зайцы-беляки, инфицированные RHDV GI. 2, были обычны в районах симпатрического проживания зайцев и кроликов. Обнаружение связанной с GI.2 смертности европейских зайцев-русаков в Австралии [211], Англии [212] и Шотландии [213] показывает, что проблема повторяется.Вспышка в Германии среди содержащихся в неволе зайцев-беляков ( Lepus timidus ) дополняет список восприимчивых видов и продемонстрировала, что молодые зайцы-беляки могут заболеть [214]. Сообщения о существенных вспышках при отсутствии местных популяций кроликов в Швеции демонстрируют потенциальную передачу RHDV GI.2 от зайца к зайцу [215]. Сообщалось также о широко распространенных случаях гибели различных видов зайцеобразных по всей территории США ([216] и новостная статья в ней), включая чернохвостого зайца ( Lepus californicus ) и пустынного кролика ( Sylvilagus audubonii ) [217].Следовательно, RHDV GI.2 демонстрирует более широкий круг хозяев, чем классический RHDV (GI.1), заражая не только разные виды кроликов, но и разные виды зайцев ( Lepus capensis mediterraneus , Lepus corsicanus, Lepus europaeus и Lepus timidus). ).

Различные виды зайцев, инфицированных RHDV GI.2, имели очень сходные клинические признаки, характерные для синдрома европейского бурого зайца (СБЗ): гиперемированные трахеи, иногда содержащие несвернувшуюся кровь, гепатитный некроз, спленомегалию и гиперемию других органов и тканей [99, 138]. , 206, 215].

Ретроспективные исследования также размыли границы, определяющие восприимчивость видов к RHDV и EBHSV. Lopes и коллеги [218] определили наличие RHDV в архивных образцах пиренейских зайцев, найденных мертвыми в 1990-х годах в Португалии с признаками EBHS-подобного заболевания [218]. Эти авторы продемонстрировали, что штаммы RHDV GI.1 в этих двух случаях были филогенетически близкородственными штаммам, циркулировавшим в то время и в тех же районах в популяциях кроликов. Эти результаты подтверждают теорию о том, что распространение вируса и высокая инфекционная нагрузка в окружающей среде могут способствовать распространению инфекции европейских зайцев-русаков RHDV GI. 2 [99, 206, 210, 211].

Анализ RHDV GI.2 положительных зайцев, отобранных в 2013 г. [210], показал наличие коинфекции EBHSV GII.1 и RHDV GI.2. Это важный вопрос эпидемиологии и эволюции, особенно потенциальное появление рекомбинантных штаммов EBHSV/RHDV GI.2.

Восприимчивость видов к лаговирусам может быть различной, и это может отражать различные видоспецифические факторы хозяина, такие как экспрессия гликанов для прикрепления вируса [170]. В связи с этим несколько исследований показывают, что, как и в случае норовирусов [219], специфическое связывание между лаговирусами и гликанами, особенно HBGA, обнаруженными в верхних дыхательных путях и кишечнике кроликов, является первым этапом вирусной инфекции [169]. , 220, 221].Кролики имеют разные типы HBGA, и разные штаммы вируса проявляют разную аффинность к этим молекулам. Тонкие изменения в этих факторах привязанности, т.е. в результате мутаций отдельные животные или даже целые виды могут стать более или менее восприимчивыми к вирусу [169, 222, 223]. Таким образом, возможным объяснением преодоления видовых барьеров может быть генетическая изменчивость капсидного белка VP60, который изменяет связывание с антигенами гистологической группы крови [223], которые считаются важными точками входа для вируса [169, 221].Другие факторы, которые могут повлиять на инфекцию RHDV GI.2 у разных видов, такие как одновременные субклинические инфекции, паразитарные инвазии, недоедание или ущерб среде обитания [138].

4. Вирусы, поражающие зайцеобразных Часть II

Серьезную озабоченность в отношении вирусов животных вызывают зоонозные инфекции. В то время как вирусный зооноз от кроликов или зайцев обычно не документируется, кролики и зайцы восприимчивы к инфекциям, которые могут заразить людей, включая бешенство, вирус гепатита Е и герпес.Восприимчивость кроликов к бешенству была использована с большой пользой, когда Луи Пастер попытался создать вакцину против бешенства в 1890-х годах. Хотя кролики восприимчивы к смертельной инфекции бешенства, они являются переносчиками инфекции. Наиболее часто задокументированным источником инфекции у кроликов являются еноты, поэтому заболевание следует рассматривать в районах, эндемичных по бешенству енотов.

4.1 Вирус гепатита Е

Вирус гепатита Е был обнаружен у домашних и диких кроликов и зайца-русака в Европе и Азии, что вызывает опасения относительно того, могут ли зайцеобразные быть резервуаром инфекций человека [224, 225].Хотя недавнее исследование не выявило наличия ВГЕ у диких зайцеобразных в Испании [226]. HEV принадлежит к семейству вирусов Hepeviridae и имеет несегментированный РНК-геном, состоящий из 3 ОРС. Существует 4 генотипа, генотипы 1 и 2 вызывают инфекции у человека, а генотипы 3 и 4 поражают виды диких животных. ВГЕ кролика имеет генотип 3. Печень или желчь являются органом-мишенью для диагностики с использованием ОТ-ПЦР, используемой для выявления генома вируса, и специфического ИФА для обнаружения антител в сыворотке. Этот патоген следует учитывать при обращении с дикими зайцеобразными.

4.2 Вирус герпеса

Источником заражения вирусом герпеса домашних кроликов называют человека. С летальным исходом инфекции были результатом контакта с человеком с герпесом. Посмертный анализ выявил инфекцию ВПГ [227].

Естественные герпесвирусные инфекции зайцеобразных были обнаружены у кроликов и зайцев, как описано в главе 1 этой книги. На сегодняшний день описано пять предполагаемых видов лепоридного герпесвируса.Герпесвирусы лепорид типов 1 и 3 были выделены из Sylvilagus floridanus [228, 229], а герпесвирусы лепорид типов 2 и 4 были выделены из Oryctolagus cuniculus [228, 229, 230]. Недавно во время вспышки миксоматоза у пиренейского зайца ( Lepus granatesis ) был зарегистрирован вирус лепоридного герпеса 5 [73, 231]. Наиболее изученная инфекция LeHV вызывается LeHV-3, который вызывает опухолевидные поражения в различных органах, таких как печень, селезенка, почки и лимфатические узлы [232].Опубликована последовательность генома LeHV-4 [233], этот вирус вызывал системное заболевание, начавшееся с острых глазных инфекций у домашних кроликов [230]. LeHV-4 был классифицирован как член подсемейства Alphavirus virinae, рода Simplexvirus . Хотя LeHV1–3 связаны с представителями рода Rhadinovirus в Gammaherpes virinae, они не были одобрены как виды (выпуск ICTV 2019 г.). Предполагается, что LeHV-5 также является вирусом гамма-герпеса [73, 231].

4.3 Папилломавирус кролика

Существует два вида папилломавируса, поражающих зайцеобразных. Первый, ранее называвшийся папилломавирусом кролика (вирус папилломы Шоупа или вирус папилломы хлопкового хвоста), преимущественно поражает хлопчатобумажного кролика ( Sylvilagus floridanus ), но может также инфицировать Oryctolagus cuniculus . В настоящее время вирус называется Sylvilagus floridanus papillomavirus 1 и принадлежит к роду Kappapapillomavirus (Van Doorslaer et al.) в семействе Papillomaviridae . Вирус размножается в тканях кожи, вызывая рост бородавок на голове и шее кроликов, которые могут стать настолько большими, что выглядят как рога, и могут препятствовать кормлению животных, если рост происходит близко ко рту. Это был первый вирус, вызывающий рак, и до 70% бородавок приводят к раковым новообразованиям. Вакцины были разработаны для использования в эндемичных регионах, а модель заражения вирусом/кроликом послужила отличной животной моделью для изучения противовирусных препаратов и вакцин.Благодаря таким исследованиям многое известно о молекулярной биологии этого вируса. Род Kappapapillomavirus также содержит второй вид вируса, названный Oryctolagus cuniculus papillomavirus 1. Заражение домашних кроликов этим вирусом вызывает самоограничивающиеся оральные бородавки или папилломы, которые регрессируют без лечения. Сообщалось также, что зайцы восприимчивы к папилломатозу [234].

Некоторые вирусы были вовлечены в качестве факторов, способствующих развитию комплекса энтерита у кроликов (REC, также называемого энтероколитом или комплексом энтерита).REC представляет собой сложное заболевание кишечника преимущественно у молодых кроликов, хотя точные причины этого неизвестны. Это многофакторное заболевание, при котором, как известно, важную роль играют бактерии, вирусы, паразиты и факторы окружающей среды. Недавно в этом отношении было проанализировано присутствие нескольких РНК-содержащих вирусов, вызывающих особую озабоченность. Ротавирус, коронавирус, астровирус и вирус гепатита Е вызывают кишечные заболевания и потенциально могут вызывать беспокойство [235].

4.4 Ротавирус кролика

Ротавирусы представляют собой важную группу двухцепочечных РНК-вирусов с сегментированным геномом семейства Reoviridae , вызывающих гастерэнтроит у млекопитающих.Ротавирус кролика или лапина относится к ротавирусу группы А и был обнаружен в нескольких странах. Ротавирусная инфекция кроликов считается фактором «многофакторной энтеропатии» [236]. В испанских крольчатниках ротавирусы кроликов были обнаружены и часто связаны с другими патогенами, такими как Eimeria spp., C. spiroforme, C. perfringens, E. coli или комбинациями этих агентов. Авторы предположили, что повреждение, вызванное репликацией ротавируса в слизистой оболочке, приводит к предрасположенности к бактериальному росту и инфекции [237].Ротавирусы, преимущественно обнаруженные у молодых выращиваемых на фермах кроликов, также были описаны у восточных кроликов ( S. floridanus ) и зайцев (беляки-беляки и европейские зайцы). Молекулярная характеристика штаммов лапинового ротавируса требует анализа ОТ-ПЦР с целевыми участками генов VP4, VP6 и VP7. Существует несколько генотипов из-за способности к рекомбинации и генетической мутации, которой обладают эти сегментированные РНК-вирусы. Сообщалось об обнаружении ротавируса кролика у младенцев человека [238, 239].

4.5 Коронавирус кролика

Коронавирус кролика был впервые описан в 1961 году после обнаружения частиц коронавируса с помощью электронного микроскопа, и в качестве органа-мишени было указано сердце [240]. Впоследствии с помощью иммуноэлектронной микроскопии был обнаружен кишечный коронавирус кролика, и вирус был выделен [241]. Кроличий кишечный CoV был обнаружен в фекалиях во время наблюдения за влажным рынком в Китае. Характеристика RbCoV, предоставившая полную последовательность генома (номер доступа в генбанке RbCoV HKU14-1 JN874559), показала, что это бета-коронавирус, и зарегистрированные случаи обнаружения RbCoV также были причастны к REC.RT-PCR и RT-qPCR были разработаны для гена RdRp.

Во время нынешней пандемии SARS-CoV2 возможность заражения животных-хозяев и создание резервуаров вызывала серьезную озабоченность. Исследования молекулярного моделирования показывают, что молекула ACE2 кролика имеет структурное сходство с ACE2 человека и, следовательно, может действовать как рецептор для проникновения вируса SARS-CoV2, что приводит к предположению, что кролик может быть восприимчив к инфекции [242]. Лабораторные кролики, привитые в экспериментальных условиях SARS-CoV2, были бессимптомными, и низкие уровни инфекционного вируса были обнаружены в мазках из носа в течение 7 дней после заражения [243]. Такие выводы подчеркивают необходимость строгих мер контроля биобезопасности на домашних кролиководческих фермах. На момент написания статьи о естественных случаях SARS-CoV2 у кроликов не сообщалось.

4.6 Астровирус кролика

Астровирусы (семейство Astroviridae ) не имеют оболочки, с одноцепочечным геномом РНК с положительным смыслом. Открытие астровируса, связанного с многофакторным заболеванием REC, подчеркнуло сложность этого заболевания и необходимость постоянного наблюдения [235].Астровирус был обнаружен у здоровых и симптоматических животных, и точная роль этого вируса в заболевании кроликов еще предстоит полностью изучить [235]. qRT-PCR, разработанный в этом исследовании, нацелен на область ORF1b (РНК-зависимая РНК-полимераза) и предоставляет необходимые инструменты для наблюдения и филогенетического анализа. Вирочип в сочетании с метагеномным анализом позволил идентифицировать и определить первую полногеномную последовательность этого агента, связанную со вспышкой энтероколита у домашних кроликов в США [244].

Метагеномные исследования вирома показали наличие астровируса у кроликов из Австралии и подчеркнули возможность его распространения насекомыми-переносчиками [245]. Однако для определения патогенеза этого вируса у кроликов требуется дополнительный анализ.

Исследования Virome также выявили новые зайцеобразные бокапарвовирусы (номер доступа в генбанке последовательности генома NC_028973) [246], пикорнавирус, калицивирусы и другие [245]. Актуальность этих вирусов для санитарного состояния зайцеобразных следует контролировать.Такие метагеномные исследования предлагают новое понимание вирусов этих видов и указывают на сложность многофакторных условий. Молекулярные инструменты, которые можно получить, несомненно, улучшат наше понимание вирусных заболеваний зайцеобразных.

Удовлетворенность клиентов имеет первостепенное значение для IntechOpen, и мы очень серьезно относимся ко всем жалобам. Наши Авторы, их учреждения и другие покупатели, если они недовольны предоставленной услугой или приобретенным продуктом, могут подать письменную жалобу в IntechOpen, 5 Princes Gate Court, London, SW7 2QJ, UK, или по следующему адресу электронной почты: info@intechopen. ком.

Получение жалоб будет подтверждено в письменной форме, и Intech Limited полностью ответит на них в течение 15 рабочих дней.

Клиенты имеют право расторгнуть договор без объяснения причин (письменное уведомление о расторжении). Крайний срок для указанного расторжения составляет четырнадцать (14) дней с даты получения товара. Возврат осуществляется за счет Клиента и должен быть осуществлен в течение четырнадцати (14) дней с даты письменного уведомления о расторжении.Intech Limited обработает возмещение Клиенту без неоправданной задержки.

В случае, если Издатель отправляет поврежденные или неправильно переплетенные копии продуктов, или если Заказчик получает дубликаты или неправильные копии продуктов, Издатель принимает возврат за счет Издателя, при условии уведомления о такой поврежденной или неправильной отправке Издателю в течение 14 (четырнадцати) рабочих дней с момента получения.

Публикационные ошибки, включая, помимо прочего, опечатки, не оказывающие существенного влияния на редакционное содержание или характеристики дизайна продуктов, не могут рассматриваться как причина для отказа в оплате или, в зависимости от обстоятельств, для изменения согласованной цены.

По требованию Издателя заказчик должен предоставить доказательства поврежденной или неправильной поставки. Издатель вернет или отправит заказанные товары без задержек.

Получение жалоб будет подтверждено в письменной форме, и Intech Limited полностью ответит на них в течение 15 рабочих дней.

Клиенты имеют право расторгнуть договор без объяснения причин (письменное уведомление о расторжении). Крайний срок для указанного расторжения составляет четырнадцать (14) дней с даты получения товара.Возврат осуществляется за счет Клиента и должен быть осуществлен в течение четырнадцати (14) дней с даты письменного уведомления о расторжении. Intech Limited обработает возмещение Клиенту без неоправданной задержки.

В случае, если Издатель отправляет поврежденные или неправильно переплетенные копии продуктов, или если Заказчик получает дубликаты или неправильные копии продуктов, Издатель принимает возврат за счет Издателя, при условии уведомления о такой поврежденной или неправильной отправке Издателю в течение 14 (четырнадцати) рабочих дней с момента получения.

Публикационные ошибки, включая, помимо прочего, опечатки, не оказывающие существенного влияния на редакционное содержание или характеристики дизайна продуктов, не могут рассматриваться как причина для отказа в оплате или, в зависимости от обстоятельств, для изменения согласованной цены.

По требованию Издателя заказчик должен предоставить доказательства поврежденной или неправильной поставки. Издатель вернет или отправит заказанные товары без задержек.

Экспрессия гена аланинаминотрансферазы 2 огурца повышает эффективность использования азота в трансгенном рисе

J Genet Eng Biotechnol.2019 декабрь; 17: 9.

атмосферу Sisharmini

¹ Программа для размножения растений и биотехнологии, департамент агрономии и Садоводство, Университет IPB (Богорский сельскохозяйственный университет), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680 Индонезия

² Индонезийский центр исследований и разработок в области сельскохозяйственной биотехнологии и генетических ресурсов, Jl.Tentara Pelajar 3A, Bogor, 16111 Индонезия

Aniversari Apriana

² Индонезийский центр исследований и разработок в области сельскохозяйственной биотехнологии и генетических ресурсов, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor, 16111 Indonesia

Nurul Khumaida

¹ Программа изучения селекции и биотехнологии растений, факультет агрономии и садоводства, Университет IPB (Богорский сельскохозяйственный университет), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680 Indonesia

Kurniawan Rudi Trijatmiko

² Индонезийский центр исследований и разработок в области сельскохозяйственных биотехнологий и генетических ресурсов, Jl.Tentara Pelajar 3A, Bogor, 16111 Indonesia

Bambang Sapta Purwoko

¹ Программа изучения селекции растений и биотехнологии, факультет агрономии и садоводства, Университет IPB (Богорский сельскохозяйственный университет), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680 Индонезия

¹ Программа изучения селекции растений и биотехнологии, кафедра агрономии и садоводства, Университет IPB (Богорский сельскохозяйственный университет), Jl. Meranti, Kampus IPB Darmaga, Bogor, 16680 Индонезия

² Индонезийский центр исследований и разработок в области сельскохозяйственной биотехнологии и генетических ресурсов, Jl.Tentara Pelajar 3A, Богор, 16111 Индонезия

Поступила в редакцию 6 сентября 2019 г.; Принято 23 сентября 2019 г.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные в ходе и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по разумному запросу. Семена растений, полученные в ходе текущего исследования, были помещены в банк семян, находящийся в ведении Индонезийского центра сельскохозяйственных биотехнологий и генетических ресурсов (ICABIOGRAD), и могут быть предоставлены директором ICABIOGRAD по разумному запросу с соответствующим соглашением о передаче материала и в соответствии с применимыми национальными или международное регулирование.

Резюме

Исходная информация

Рис может поглощать менее 40% внесенных азотных удобрений, в то время как неабсорбированные азотные удобрения могут вызвать экологические проблемы, такие как цветение водорослей в пресной воде и увеличение производства закиси азота, парникового газа, который В 300 раз сильнее, чем углекислый газ. Разработка риса с эффективным использованием азота (ЭИА) имеет важное значение для более экологически чистого производства риса. Недавно NUE риса был разработан путем специфичной для корней экспрессии гена аланинаминотрансферазы ( AlaAT ) из ячменя, однодольного растения.Поэтому мы проверили эффективность гена AlaAT из огурца в трансгенном рисе, стремясь предоставить доказательства сохранения функции гена AlaAT у однодольных и двудольных растений.

Результаты

Ген AlaAT из огурца ( CsAlaAT2 ) был успешно клонирован и сконструирован на векторах экспрессии растений pCAMBIA1300 под контролем тканеспецифического промотора OsAnt1 . Agrobacterium tumefaciens — опосредованная трансформация индонезийского риса сорта.Фатмавати, используя эту конструкцию, произвела 14 трансгенных событий. Предварительный скрининг проростков Т1, выращенных в агаризованной среде с низкой концентрацией азота, выявил отдельные события, которые превосходили по сухому весу корней. Саузерн-гибридизация подтвердила интеграцию Т-ДНК в выбранные событийные геномы, каждый из которых нес 1, 2 или 3 вставки Т-ДНК. Анализ эффективности трех свинцовых объектов в теплице показал, что в целом трансгенные объекты имели повышенную биомассу, число побегов, содержание азота и урожайность зерна по сравнению с WT.Одно событие, то есть FAM13, показало увеличение урожайности на 27,9% и увеличение биомассы растений на 27,4% по сравнению с WT в условиях низкого содержания азота. События со свинцом также продемонстрировали более высокую абсорбционную ЭИА, агрономическую ЭИА и ЭИА зерна по сравнению с WT в условиях низкого содержания азота.

Выводы

Результаты этого исследования показали, что специфичная для корней экспрессия гена аланинаминотрансферазы 2 огурца повышает эффективность использования азота в трансгенном рисе, что указывает на сохранение функции этого гена у однодольных и двудольных растений.

Ключевые слова: Аланинаминотрансфераза , Огурец, Эффективность использования азота, Рис

Справочная информация

Усилия по увеличению производства риса в мире должны продолжаться для удовлетворения растущего спроса на рис. Зеленая революция 1960–1970 годов привела к значительному увеличению производства риса. Однако чрезмерное использование удобрений и пестицидов оказывает негативное воздействие на окружающую среду и плодородие почвы. Зеленая революция и удвоение производства продуктов питания за последние четыре десятилетия связаны с увеличением использования азотных удобрений [10].Использование азота также возрастает с 3,5 млн т в 1960 г. до 87 млн ​​т в 2000 г., и ожидается, что к 2050 г. оно увеличится до 249 млн т [32]. Текущая доза удобрений 400–600 кг мочевины/га, обычно используемая фермерами в Индонезии, превышает рекомендацию правительства 200–260 кг/га [33].

Азот активно усваивается растениями из почвы в виде аммиачной и нитратной селитры [2, 8, 9, 21, 25]. Азот является важным питательным веществом, используемым растениями для их роста и развития в качестве компонентов ДНК, белков, ферментов и продуктов метаболизма, участвующих в синтезе и переносе энергии [6, 17].Нитраты и аммоний являются двумя неорганическими соединениями азота, присутствующими в сельскохозяйственных почвах и очень подвижными в почве. Растение способно использовать только около 30–40% доступного азота. Таким образом, более 60% почвенного азота теряется в результате сочетания выщелачивания, поверхностного стока, денитрификации, улетучивания и потребления почвенными микроорганизмами. При расчетах повышение эффективности использования азота на 1% может сэкономить 1,1 млрд долларов США в год [15]. Таким образом, минимизация потерь азота может уменьшить загрязнение окружающей среды и снизить себестоимость продукции.

Среди генов, которые использовались для повышения эффективности использования азота у растений, есть аланинаминотрансфераза ( AlaAT ) [5, 28]. AlaAT представляет собой пиридоксаль-5′-фосфат-зависимый фермент, обнаруженный во всех частях растения. Эта ферментативная активность обнаруживается не только в листьях и корнях, но и в других тканях, таких как эндосперм и цветок [13]. Паттерн экспрессии AlaAT показывает, что этот фермент участвует в важных биохимических реакциях на протяжении всего жизненного цикла растения. Этот фермент катализирует обратимую реакцию между пируватом и глутаматом с образованием аланина и 2-оксоглутарата, связывая метаболизм углерода с синтезом различных аминокислот [20, 26].

Сообщалось об исследовании использования гена AlaAT из ячменя на Brassica napus с использованием специфичного для корней промотора btg26. Трансгенные растения Brassica показывают улучшение эффективности использования азота по сравнению с нетрансгенными растениями, о чем свидетельствует увеличение биомассы и урожайности семян в условиях низкого содержания азота в лабораторных и полевых испытаниях [5].Гетерологическую экспрессию AlaAT ячменя в трансгенном рисе также проводили с использованием промотора специфической ткани OsAnt1 . Эта модификация может значительно увеличить биомассу и урожай зерна трансгенного риса по сравнению с контрольными растениями, когда растения снабжаются достаточным количеством азота. Трансгенные растения также показали значительные изменения в содержании азота и метаболизме. Этот результат свидетельствует об улучшении эффективности использования азота [28].

Улучшение поглощения азота злаковыми растениями может быть достигнуто путем манипулирования нижестоящим этапом пути метаболизма азота [28].Разработка продовольственных культур, которые могут более эффективно поглощать и перерабатывать азот для усвоения, позволит эффективно использовать азотные удобрения, что может снизить себестоимость производства и не навредить окружающей среде [7]. В обширном исследовании гена AlaAT для повышения эффективности использования азота использовался ген ячменя, принадлежащий однодольным растениям. Необходимо начать изучение генов двудольных AlaAT , чтобы изучить возможную функциональную консервативность этого гена среди однодольных и двудольных и найти ортологичные, которые могут быть полезны для целей оптимизации генов в будущем.

Целью данного исследования было изучение эффективности гена огурца AlaAT2 , управляемого специфичным для корней промотором OsAnt1 , в улучшении эффективности использования азота в трансгенном рисе. Наши результаты показывают, что ген огурца AlaAT2 может быть использован для создания трансгенных сортов риса, эффективных при использовании азотных удобрений.

Методы

Создание конструкций для трансформации растений и трансгенного риса

Фрагмент, охватывающий полноразмерную кодирующую область CsAlaAT2 , был амплифицирован из гибрида F1 огурца ( Cucumis sativus L ) сорта.Корневая кДНК Роберто (Chia Tai Seeds Co.). Поскольку активность фермента аланинаминотрансферазы индуцируется в условиях гипоксии [4], перед выделением РНК образцы растений помещали в условия гипоксии по методике, описанной Kendziorek et al. [16]. Вкратце, гипоксию вызывали путем погружения корней и побегов 10-дневных проростков огурцов на 1/3 длины в колбы с раствором Йошиды, покрытые примерно 2-сантиметровым слоем масла для предотвращения газообмена. Тотальную РНК выделяли из корня, обработанного гипоксией, с использованием набора RNeasy Plant Mini Kit, как описано поставщиком (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд, США). Амплификацию гена Cs AlaAT2 проводили с использованием смеси ДНК-полимеразы FastStart Taq (Roche) и ДНК-полимеразы KAPA Hifi Hotstart (Kapa Biosystems, Уилмингтон, Массачусетс, США) и олигонуклеотидов CsAlaAT2 -FL-F (5′). -gcggatccCGGCTACACCACCAACTCTT-3′) и CsAlaAT2 -FL-R (5′-gcggtaccTGCACCTTTGATACGCAGGA-3′). Олигонуклеотиды вводили сайты рестрикции Bam HI и Kpn I (нижний регистр) в амплифицированные фрагменты на их 5′- и 3′-концах соответственно.Промотор OsAnt1 амплифицировали из геномной ДНК риса cv. Kitaake с использованием ДНК-полимеразы FastStart Taq и специфических олигонуклеотидов для промотора OsAnt1 [35]. Олигонуклеотиды вводили сайты рестрикции Hin dIII и Bam HI в амплифицированные фрагменты на их 5′- и 3′-концах соответственно. Фрагменты CsAlaAT2 и OsAnt1 вводили в вектор pGEM-T Easy, как описано производителем (Promega, Madison, WI), и затем секвенировали перед расщеплением и лигированием в бинарный вектор. Фрагменты промотора и гена с соответствующими совместимыми когезионными концами лигировали вместе с бинарным вектором Hin dII- Kpn I pCAMBIA1300int-prGluA2-GUS-tNOS [34] в качестве замены для GluA2 промотора и гена GUS для создания pCAMBIA1300int-prOsAnt1. — ЦАлаАТ 2-тНОС. Бинарный вектор трансформировали в штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 [11] методом замораживания-оттаивания [12]. Трансформация риса сорта. Фатмавати (коллекция Индонезийского центра исследований риса с инвентарным номером4825) выполняли по методу, описанному Slamet-Loedin et al. [30]. Вкратце, незрелые эмбрионы культивировали совместно с суспензией Agrobacterium в течение 7 дней. Удлиненные побеги удаляли, а зародыши переносили на среду покоя. Через 5 дней эмбрионы переносили на среду для селекции, содержащую гигромицин, и инкубировали в течение 10 дней. Вторую селекцию проводили в течение 10 сут. Эмбриогенные каллусы отбирали и переносили на свежую среду для селекции. Через 10 сут устойчивые каллусы переносили на предрегенерационную среду и инкубировали в течение 10 сут. Пролиферирующие каллусы с зелеными пятнами переносили на среду для регенерации. Проростки переносили на среду для укоренения и инкубировали в течение 14 дней. Для подтверждения присутствия трансгена CsAlaAT2 в трансформированных растениях с использованием набора KAPA 3G Plant PCR Kit (Kapa Biosystems) и олигонуклеотидов CsAlaAT 2-F: 5′-ATAAAGCAGAAGGCGCAATG-3′ и tNOS- проводили прямую ПЦР с листовым диском в качестве матрицы для подтверждения присутствия трансгена CsAlaAT2 в трансформированных растениях. R: 5′-ATTGCCAAATGTTTGAACGA-3′.

Предварительный скрининг событий на агаризованной среде с низкой концентрацией азота

Предварительный скрининг событий проводили путем проращивания семян трансгенного риса T1 на агаризованной среде, содержащей макроэлементы, микроэлементы и витамины, согласно Мурасиге и Скугу [23], за исключением для NH ₄ NO ₃ и KNO ₃ , где использовали прочность 1/16. Каждое семя Т1 проращивали в стеклянной пробирке (диаметр 25 мм × высота 200 мм), содержащей 25 мл агаровой среды.Проростки инкубировали на постоянном свету при температуре 28 °С. Сеянцы собирали через 21 день после посева для оценки 6 признаков: (1) длина корня, (2) длина побега, (3) сырая масса корня, (4) сырая масса побега, (5) сухая масса корня и ( 6) стрелять сухим весом. Сухая масса корней использовалась в качестве критерия для выбора ведущих событий, поскольку предыдущие исследования показали, что экспрессия аланинаминотрансферазы ячменя приводит к раннему созданию мощной корневой системы у трансгенного риса [27, 28].

Молекулярная характеристика

Пять случаев, показавших более высокую сухую массу корня, чем в контроле (таблица ), были оценены для числа вставок Т-ДНК с использованием анализа саузерн-блоттинга в соответствии с методом, описанным Trijatmiko et al. [35]. Вкратце, образцы ДНК расщепляли ферментом с одним разрезом ( EcoRI ), разделяли электрофорезом в агарозном геле, денатурировали, переносили на нейлоновую мембрану и гибридизовали с зондом гигромицинфосфотрансферазой ( hpt ) (рис. а). Зонд метили DIG-dUTP (Roche) методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидов hpt -F (5′-GCATCTCCCGCCGTGCAC-3′) и hpt -R (5′-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3′). Детекцию проводили с использованием антитела против дигоксигенина, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Roche), и хемилюминесцентного субстрата (Roche). Световой сигнал был зафиксирован на рентгеновской пленке (Hyperfilm ECL, GE Healthcare, Чикаго, Висконсин, США).

Таблица 1

Признаки корней и побегов контрольных и трансгенных растений риса в среде MS, содержащей 1/16 концентрации азота Сухая биомасса Корень (г) Побег (г) Корень (г) Побег (г) Контроль 13 1336674 33,32 0,11 0,16 0,019 0,031 91 331 FAM1 9,47 31,40 0,11 0,16 0,018 0,027 91 331 FAM2 11,17 32 , 90 0. 11 0.17 0.019 0.032 Fam3 9.10 9.10 33.07 0.12 0,17 0,17 0.020 0,028 FAM4 9.60 32,13 0,12 0,17 0,021 0,034 FAM5 16,37 * 32,43 0,17 ** 0,19 0,033 * 0. 0346 0.033 FAM6 11.33 32.53 0.11 0.17 0,017 0.017 0.025 0.025 Fam8 8.30 22,87 0,09 0,13 0,016 0,019 девяносто одна тысяча триста тридцать один FAM9 10,83 33,60 0,11 0,16 0,018 0,030 девяносто одна тысяча триста тридцать один FAM10 14,07 33. 13 0.10 0.17 0.014 0.027 11.40 11.40 29.30 0.08 0.08 0,14 0.014 0,022 FAM13 9.80 28,67 0,19 ** 0,18 0,030 * 0,033 FAM16 9,87 32 0,093 0,183 0,016 0. 025 91 331 FAM17 9,97 32,43 0,107 0,180 0,017 0,026

развития и молекулярной характеристики CsAlaAT2 трансгенного риса событий. a Схематическая диаграмма конструкции Т-ДНК OsAnt1::CsAlaAT2 , содержащей ген CsAlaAT2 с терминатором NOS под контролем промотора OsAnt1 . РБ, правая граница; pr OsAnt1 , промотор антиквитин1; CsAlaAT2 , Cucumis sativus Аланинаминотрансфераза ; tNOS – терминатор нопалинсинтазы; pr 35 S, промотор 35 S; hpt, гигромицинфосфотрансфераза; C35S, цветная капуста 35 S; ЛБ, левая граница. b ПЦР-амплификация огурца AlaAT на трансгенных линиях риса T0.M = 1 т.п.н. лестница ДНК плюс; 1–14 = трансгенные линии, WT = дикий тип, P = плазмидный контроль. c Саузерн-блот-анализ, показывающий количество копий hpt вставки гена в поколении T0 трансгенных линий. Вставка гена Hpt показана белой стрелкой. M = маркер 1 КБ лестница, WT = дикий тип, 1 = fam3, 2 = fam4, 3 = fam5, 4 = fam 9, 5 = fam13, p = fam 9, 5 = fam13, p = плазмида pcambia1301- csalaat2

фенотипическая оценка трансгенного растения

начальных значений T1 трех выбранных событий, т.е.е., FAM3, FAM5 и FAM13 использовали для фенотипической оценки в теплице. Семена контрольных растений и трансгенных линий проращивали в чашках Петри в течение 2  дней, а затем переносили на лотки для проращивания. ПЦР проводили на 2-недельных проростках для отбора трансген-позитивных растений. Отобранные сеянцы были пересажены в горшки для оценки эффективности использования азота.

Оценка проводилась в теплице с обработкой азотом в соответствии с Selvaraj et al.[27], т.е. N0 = 0 кг/га, N1 = 90 кг/га, N2 = 180 кг/га, что было переведено в объем почвы в горшке. Для N1 и N2 азот применяли тремя равными частями через 2 дня после переноса (DAT), 10 DAT и 30 DAT.

Наблюдения проводились за агрономическими признаками, включая высоту растений, количество метелок, длину метелок, количество наполненных зерен, процент завязывания семян, массу 1000 зерен, урожайность, сухую массу корней и сухую массу побегов. Концентрацию азота в корнях и концентрацию азота в побегах измеряли методом Кьельдаля [14].

Агрономические данные были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа, реализованного в системе статистического анализа (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, США). При наличии значимого эффекта для модельного источника вариации использовалась процедура разделения средних с наименьшей значимой разницей Фишера на уровне P  = 0,05. Значение абсорбции NUE (aNUE) рассчитывали путем деления общего азота, поглощенного растением (граммы), на количество применяемого азота (граммы). Агрономическая ЭИА (агЭИА) рассчитывалась путем деления общей сухой биомассы растения (грамм) на количество внесенного азота (грамм). ЭИЭ зерна (gЭИЭ) рассчитывали путем деления урожая растения (грамм) на количество внесенного азота (грамм) [19, 22].

Результаты

Создание конструкций для трансформации растений и трансгенного риса

ПЦР-продукт, включающий открытую рамку считывания гена CsAlaAT2 (∼ 1,565 kb), успешно амплифицирован из кДНК корня огурца, встроенной в векторную систему pGEM-T easy , и последовательно. Фрагмент CsAlaAT2 из правильного клона вырезали с помощью Bam HI и Kpn I и лигировали вместе с Hin dIII- и Bam HI-расщепленным фрагментом pOsAnt1 с получением бинарного вектора pCAMBIAintNos1300. вектор трансформации растений pCAMBIA1300int- pOsAn1t — CsAlaAT2- tNos (рис.а). Затем вектор трансформировали в штамм LBA4404 Agrobacterium tumefaciens и использовали для трансформации риса. Количество трансгенных объектов, созданных с помощью pCAMBIA1300int- pOsAnt — CsAlaAT2 -tNos, составило 14. Подтверждение с помощью ПЦР-амплификации показало, что все 14 объектов несли трансгенов CsAlaAT2 (рис. b). Из положительных событий 13 дали не менее 200 семян.

Предварительный скрининг событий на агаризованной среде с низкой концентрацией азота

Растения T1 13 отобранных трансгенных объектов риса (FAM) были предварительно проверены на агаризованной среде с низким содержанием азота.Наблюдение через 21 день после посадки показало, что биомасса корней двух трансгенных объектов, т. е. FAM5 и FAM13, была значительно выше, чем у контрольного растения (таблица).

Молекулярная характеристика выбранных событий

Саузерн-блот-анализ с использованием Eco RI, который разрезал только один раз в Т-ДНК, и зонда hpt был проведен на 5 выбранных трансгенных объектах T0, т. е. FAM3, FAM4, FAM5, FAM9 , и FAM13, и дикого типа. Из выбранных событий 3 события (FAM3, FAM9 и FAM13) показали одну вставку Т-ДНК, 1 событие (FAM4) показало 2 вставки Т-ДНК и 1 событие (FAM5) показало 3 вставки Т-ДНК. Как и ожидалось, растение дикого типа (контроль) не показало никакой гибридизации (рис. c). Три события с одиночной вставкой Т-ДНК показали разные размеры полос, что указывает на то, что каждое из них является уникальным событием.

Фенотипическая оценка выбранных объектов

Фенотипическая оценка трех выбранных объектов, т. е. FAM3, FAM5 и FAM13, была проведена в теплице. Растения T1 отобранных событий и дикого типа выращивали в горшках при 3 различных дозировках азота, т. е. 0 кг/га, 90 кг/га и 180 кг/га.

Коэффициенты корреляции между признаками рассчитаны и представлены в табл. Число кустистости было единственным признаком, который показал положительную корреляцию с урожайностью зерна. Количество кустов имело положительную корреляцию с сухой массой корней. Сухая масса побегов положительно коррелировала с сухой массой корней, концентрацией азота в корнях и концентрацией азота в побегах.

Таблица параметров 2

Выхода измеренных от парникового эксперимента трех CsAlaAT2 свинца событий и WT до трех N режимов удобрений

Н уровня	Генотипа	RDW	SDW	КРСА	SNC	TN	GY
N 0%	Контроль (WT)	4. 57 х	18,50 F	0,06	0,14 с	7,0 Ьсом	30,59 Ьсом
	FAM3	6,90 BCD	19,95 четкостью	0.10	0.22 BC			2949 BC
	9139
	813999	8,46 AB	23.13 CDEEF	0.12	0,34 AB	8,0 аЬс	29,11 Ьс
FAM13	5,33 CDE	19,44 эф	0,06	0,23 Ьс	9,0 A +	34,32 аЬс +
N 50%	управления (WT)	4,92	20,84		0,08 0,20	6. 3 девяносто одна тысяча девяносто-дв Ьс	31,48 девяносто одна тысяча девяносто-дв Ьс
	FAM3	7,49 девяносто одна тысяча девяносто-дв Ьс	24,11 девяносто одна тысячи девяносто-два BCD	0,14	0,25 Ьса	8.3 AB	37.58 AB
		FAM5 7,38 + BCD	20,36 + CDEF		0,13 0,30 91 092 аЬс	8,7 91 092 аб	32,62 аЬс
	девяносто одна тысяча триста тридцать один FAM13	7. 09 91 092 BCD	24,69 91 092 BCD	0,08	0,24 аЬс	9.0 91 092	40,28 91 092
управления (WT)	5,32 91 092 CDE	24,51 BCDE		0,09 0,18	7.0	30,55
91 331 FAM3	9,30 AB	34.83	0,13	0,42	8. 3 AB	33,02 аЬс
FAM5	7,28 BCD	25,38 Ьс	0,09	0,27 аЬс	9,0	28,78 с
	FAM13 10.13	29,27	0,12	0,23	9.0 91 093 девяносто одна тысяча девяносто-два	34,09 аЬс 91 093 девяносто одна тысяча девяносто-два
девяносто одна тысяча триста тридцать-один уровень Н (N)		*	**		нс нс нс		*
девяносто одна тысяча триста тридцать-один генотип (G)		*	*		нс *	**	*
91 331 Н × G			* *		нс нс нс
CV (%)		18. 59	11.37	34,31	35,50	11,08	13,32

Значительные различия были обнаружены при обработке азотом (T) и взаимодействии генотипа (G) с сухим корнем . Значимые различия были выявлены также у генотипа (G) по концентрации N в побегах, числу побегов и урожайности зерна (таблица).

Таблица 3

Корреляция между признаками (все показанные корреляции значимы при P  < 0.05)

Тре	PH	TN	PL	ГПП	RDW	SDW	КРС	SNC
TN	—
PL	—	—
GPP	—	—	—
RDW	–	0. 356	—	—
	SDW —	—	—	—	0,636 **
	КРС —	—	—	—	0,553 **	0,368
	SNC —	—	—	—	0. 397	0,554 **
	GY —	0,449 **	—	—	—	—	—	—

Корень сухой вес FAM 3 и FAM13 были значительно выше, чем WT при N 90  кг / га, тогда как FAM5 был значительно выше, чем WT при N 0  кг / га (рис. а и таблица). Трансгенные растения показали более длинную и плотную корневую систему, чем контрольные растения (рис.). Сухая масса побегов FAM3 была значительно выше, чем WT при N 180 кг/га (рис. б и таблица). Количество стеблей у FAM3 и FAM 13 было значительно выше, чем у WT при N 90 кг/га и N 180 кг/га, тогда как у FAM5 оно было значительно выше, чем у WT только при N 90 кг/га (рис. c, табл. Инжир. ). Урожайность зерна FAM13 значительно превосходила WT при N 90  кг/га (рис. d и таблица).

Эксперимент в теплице для оценки эффективности использования азота в трансгенных растениях и диком типе. a Сухая масса корней трех трансгенных объектов и дикого типа при дозах 3 N. b Сухой вес побегов трех трансгенных объектов и дикого типа при дозах 3 N. c Тиллер число трех трансгенных событий и дикого типа при дозах 3 N. d Урожай зерна трех трансгенных объектов и дикого типа при дозах 3 N. Столбцы представляют собой средние значения ± sd. из трех повторностей. Средние значения, отмеченные *, указывают на значительные отличия от WT при соответствующей дозе N при P  < 0.05

Характеристики трансгенного риса T1 и WT на стадии сбора урожая в условиях низкого содержания азота в теплице. A1 = отросток объекта FAM13, A2 = отросток дикого типа, B1 = корень объекта FAM13, B2 = корень объекта FAM13, B2 = корень дикого типа

Все трансгенные объекты показали более высокое общее содержание азота, чем дикий тип (таблица). Трансгенные объекты при N 90  кг/га показали более высокую ЭИА зерна, чем при N 180  кг/га (таблица). Хотя в целом увеличение эффективности поглощения азота трансгенными объектами при N 180  кг/га было выше, чем при N 90  кг/га, увеличение урожайности зерна трансгенных объектов при N 90  кг/га было в целом выше, чем при N 180 кг/га (таблица).

Таблица 4

абсорбция, агрономическое и значение NUE зерна в CsAlaAT2 трансгенных событиях

Линия +	символов +	N дозировка удобрений +
		Н 50% +	Н 100% +
Дикий тип	Общая биомасса (грамм / холм)	25,76 ± 1,99	25,76-199	29,83 ± 1,19
	Выход из зерна / завод (грамм / холм)	31. 48 ± 3,06	30.55 ± 6,18
	Содержание азота в растительных	0,28 ± 0,1	0,27 ± 0,03
	Поглощение NUE	0,284	0,14
	Агротехнические NUE	25,76	14,91
	Зерно Нью	31346	31.48	15.28
FAM3	FAM3	Общая биомасса (грамм / холм)	31.6 ± 3.36	44.13 ± 1,36
Выход из зерна / завод (грамм / холм)	37. 58 ± 3,57	33,02 ± 5,23
Содержание азота в растительных	0,39 ± 0,07	0,56 ± 0,13
Поглощение NUE	0,386	0,28
Агротехнические NUE	31,60	22.06
зерна Нью	37.60	16	16
Увеличение N поглощения эффективности (%) *	34.48	107,4	107.4
Увеличение урожайности зерна (%) **	19. 40	8
FAM5	Общая Биомасса (грамм / холм)	30,91 ± 0,88	37,74 ± 1,33
	Зерно Выход / растение (грамм / холм)	33,02 ± 3,42	30,63 ± 3,34
	содержание азота в растительных	0,43 ± 0,06	0,36 ± 0,12
		0,376	0,297
		30,91	18.87
		33	15,3
	Увеличение N эффективности поглощения (%) *		48,27 33,33
	Увеличение урожайности зерновых (%) **		4. 9 0,3
FAM13	Общая Биомасса (грамм / холм)	31,78 ± 4	39,39 ± 1,45
	Зерно выход / растение (грамм / холм)	40,28 ± 3,53	34,09 ± 3,00
	Содержание N в растениях	0.32 ± 0,02	0,35 ± 0,07
	Поглощение NUE	0,35	0,159
	Агротехнические NUE	31,78	19,70
	Зерно NUE	40,2	17
	Увеличение N поглощение эффективности (%) *	10. 34		29.63
	Увеличение урожайности зерна (%) **	27.95	11.58	11.58	11.58

Обсуждение

в нашем эксперименте по предварительным скринге, среди 13 событий оценено только 2 события, т.е.е. FAM5 и FAM13 показали значительно более высокую биомассу корня, чем контрольное растение. Это обычное дело для генной инженерии, направленное на улучшение определенных признаков растений, как показано в «Золотом рисе 2» [24]. Из 619 разработанных событий только 23 показали высокое содержание каротиноидов. Различия между событиями в уровне эффективности определяются несколькими факторами, такими как количество копий, позиционный эффект и целостность вставки Т-ДНК.

Наши результаты показывают, что экспрессия огурца AlaAT2 в трансгенных растениях риса под контролем специфичного для корней промотора ( OsAnt1 ) увеличивала биомассу корней, число побегов и урожайность зерна. По сравнению с контролем трансгенные растения риса показали значительное увеличение содержания азота.

Корреляционный анализ между признаками показал, что единственным признаком, имеющим положительную корреляцию с урожайностью зерна, была кустистость. С другой стороны, сухая масса корня была единственным признаком, который имел положительную корреляцию с количеством побегов. По сравнению с контролем, трансгенные растения показали более длинную и плотную корневую систему (рис. 1), что может быть полезным для трансгенных растений, поскольку известно, что система архитектуры корней тесно связана с эффективностью поглощения азота и является основным определяющим фактором для эффективность использования азота [19, 37].

Сверхэкспрессия CsAlaAT2 в корне может вызвать гипоксическиподобный ответ, стимулирующий биосинтез этилена [1]. Этилен известен своей ролью в стимулировании роста и развития корней [3]. Кроме того, избыточная экспрессия AlaAT увеличивает использование и продукцию глутамата [1], который известен своей ролью в модулировании митотической активности в апикальной меристеме [18, 36] и динамическом удлинении файлов корневых клеток [29]. ].

Корневая экспрессия CsAlaAT2 также может продуцировать аланин, который транспортируется к побегам для использования или хранения.В отличие от глутамата, растения не ощущают транспорт азота в виде аланина, что приводит к формированию петли положительной обратной связи, при которой растение улучшает усвоение азота и, в свою очередь, улучшает метаболизм углерода [1].

Мы протестировали три трансгенных объекта для фенотипической оценки в теплице. В целом трансгенные объекты сохраняли более высокое число побегов по сравнению с WT, независимо от уровней N (рис. c). Это улучшение способности к кущению может быть связано с повышенным содержанием азота в трансгенных растениях (таблица).Ранее было показано, что каждый узел соломы риса содержит зачаток побега, а формирование побегов в значительной степени зависит от запасов азота и углеводов в соломе [31].

Трансгенные объекты продемонстрировали повышение урожайности до 28% по сравнению с WT при выращивании с ограничением N50% и более низкое увеличение урожая (до 12%) при выращивании с ограничением N100%. Способность трансгенных растений поглощать азот при N100% не является ограничивающим фактором, потому что трансгенные растения показали более высокое увеличение эффективности поглощения N при выращивании при N100% (29.63–107,4 %) по сравнению с менее 50 % (4,9–34,48 %). Вместо этого это может указывать на то, что 90 кг/га азота (N50%) является оптимальной дозой для достижения хорошего баланса с дозами фосфора и калия, которые мы использовали в этом эксперименте. Ранее на рисе было показано, что зависимость между дозой азотных удобрений и урожайностью зерна не является линейной [38].

Выводы

Таким образом, мы представляем здесь разработку трансгенных растений риса, сверхэкспрессирующих CsAlaAT2 , и оценку реакции этих растений на различные уровни поставляемого N.Мы идентифицировали трансгенный объект, который имел значительно более высокую урожайность зерна, чем контроль дикого типа при N 90  кг/га. Повышение урожайности коррелировало с увеличением числа побегов. Трансгенные растения риса показали значительное повышение эффективности использования азота. Наши текущие результаты показывают, что ген огурца AlaAT2 эффективен для повышения эффективности использования азота в трансгенном рисе. Использование этого гена для крупномасштабной трансформации должно дать возможность идентифицировать трансгенные объекты риса, которые обладают большей эффективностью использования азота и в то же время имеют фенотип, состав питательных веществ и молекулярные характеристики, соответствующие нормативным требованиям биобезопасности.Культивирование этих высокоэффективных и чистых мероприятий NUE окажет значительное экономическое и экологическое воздействие на сельскохозяйственную систему, основанную на рисе.

Благодарности

Мы благодарим Nuryati, H. Hersusatio, M.H. Мубарок, Д. Шриюлита и М.И. Ридван для технического помощника. Мы благодарим д-ра Inez Slamet-Loedin за плодотворное обсуждение. Агрономическая эффективность использования азота Дисперсионный 91 346 Дисперсионный анализ aNUE 91 346 Поглощение эффективность использования азота С 91 346 углерода кДНК 91 346 комплементарной ДНК CsAlaAT 91 346 Cucumis Sativus аланинаминотрансфераза CsAlaAT 2-FL-F CsAlaAT2 -full Длина вперед CsAlaAT 2-FL-R CsAlaAT2 -full длины обратного ДАТ дней после передачи DIG дигоксигенином DW Сухой вес (г) GluA2 глютелина А2 GNUe использование азота Зерно эффективность ГПП зерен в метелки GUS Glucoronidase GY зерна выхода (г / растение) HPT-F гигромицина фосфотрансферазу вперед HPT-R гигромицин фосфотрансферазных -реверс MS Мурасиге и Скуг N Азот 9134 NS NS NUE Нью Экций азота Использование Osant1 Oryza Sativa Antiquitin 1 ПЦР Полимеразная цепная реакция PH растений высота PL Метелка Длина RDW Корень веса сухой (г) РНК рибонуклеиновой кислоты RNC RUST N концентрация (мг / г / г / г дсу) SDW SW SNC SNC SHONC N концентрация (мг / г DW) т -DNA TN TN TN WT Дикий тип

Взносы авторов

Как задумано оригинальная идея. Идею развили BSP, KRT и NK. А.С. и А.А. проводили эксперименты. BSP, KRT и NK руководили проектом. AS проанализировала данные и написала рукопись в консультации с BSP, KRT и NK. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Это исследование финансировалось за счет грантов Индонезийского агентства сельскохозяйственных исследований и разработок (Регистрационный № 1798.201.052.A) (в AS), Программы стипендий Министерства сельского хозяйства Индонезии (в AS) и SMARTD (Устойчивое управление). сельскохозяйственных исследований и распространения технологий) проект (для AS).Спонсоры не участвовали в разработке исследования; в сборе, анализе и интерпретации данных; и при написании рукописи.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, созданные в ходе и/или проанализированные в ходе текущего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу. Семена растений, полученные в ходе текущего исследования, были помещены в банк семян, находящийся в ведении Индонезийского центра сельскохозяйственных биотехнологий и генетических ресурсов (ICABIOGRAD), и могут быть предоставлены директором ICABIOGRAD по разумному запросу с соответствующим соглашением о передаче материала и в соответствии с применимыми национальными или международное регулирование.

Одобрение этики и согласие на участие

Неприменимо.

Согласие на публикацию

Неприменимо.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Примечание издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Ссылки

1. Битти Перрин Х., Шрават Ашок К., Кэрролл Ребекка Т., Чжу Тонг, Гуд Аллен Г. Транскриптомный анализ азотоэффективного риса, сверхэкспрессирующего аланинаминотрансферазу. Журнал биотехнологии растений. 2009;7(6):562–576. doi: 10.1111/j.1467-7652.2009.00424.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]2. Дечоргнат Дж., Нгуен К.Т., Арменго П., Жосье М., Дятлофф Э., Филлер С., Веделе Ф.Д. Из почвы в семена: долгий путь нитратов в растениях. J Опытный бот. 2011;6:1349–1359. doi: 10.1093/jxb/erq409. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3.Feng Y, Xu P, Li B, Wen X, An F, Gong Y, Xin Y, Zhu Z, Wang Y, Guo H. Этилен способствует росту корневых волосков посредством скоординированной активности EIN3/EIL1 и RHD6/RSL1 у арабидопсиса. ПНАС. 2017;114(52):13834–13839. doi: 10.1073/pnas.1711723115. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Гуд А.Г., Джонсон С.Дж., Де Пау М., Кэррол Р.Т., Савидов Н., Видмар Дж., Лу З., Тейлор Г., Строер В. Инженерная эффективность использования азота с аланинаминотрансферазой . Может Джей Бот. 2007; 85: 252–262. дои: 10.1139/В07-019. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 6. Хао Ц.Н., Чжоу С.А., Ша А.Х., Ван С., Чжоу Р., Чен С.Л. Идентификация генов, связанных с эффективностью использования азота, путем полногеномного транскрипционного анализа двух генотипов сои. Геномика BMC. 2011;12(525):1–15. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]7. Хашимото М., Хераи Ю., Нагаока К., Коно К. Выщелачивание нитратов в гранитной регозоле под влиянием поглощения и транспирации азота кукурузой. Почвоведение Растениеводство. 2007; 53: 300–309. doi: 10.1111/j.1747-0765.2007.00134.х. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]8. Хейнс Р.Дж., Го К.М. Аммиачное и нитратное питание растений. Биол.Rev. 1978; 53: 465–510. doi: 10.1111/j.1469-185X.1978.tb00862.x. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]9. He X, Qu B, Li W, Zhao X, Teng W, Ma W, Ren Y, Li B, Li Z, Tong Y. Индуцируемый нитратами транскрипционный фактор NAC TaNAC2-5A контролирует реакцию на нитраты и увеличивает урожайность пшеницы. Завод Физиол. 2015;169(3):1991–2005. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]10. Хирел Б., ЛеГуи Дж., Ней Б., Галле А. Задача улучшения ЭИА сельскохозяйственных культур: к более центральной роли генетической изменчивости и количественной генетики в рамках комплексных подходов.J Опытный бот. 2007; 58: 2369–2387. doi: 10.1093/jxb/erm097. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA. Стратегия бинарного растительного вектора, основанная на разделении вир- и Т-областей Agrobacterium tumefaciens Ti-плазмиды. Природа. 1983; 303: 179–180. дои: 10.1038/303179a0. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 12. Холстерс М., Де Вале Д., Депикер А., Мессенс Э., Ван Монтегю Э. Трансфекция и трансформация Agrobacterium tumefaciens . Мол Ген Жене.1978; 163: 181–187. doi: 10.1007/BF00267408. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 13. Игараси Д., Мива Т., Секи М., Кобаяси М., Като Т., Табата С., Шинозаки К., Осуми С. Идентификация фотодыхательного глутамата: ген глиоксилатаминотрансферазы (GGAT) в Arabidopsis . Плант Дж. 2003; 33: 975–987. doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01688.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Джонс Дж. Б., редактор. Справочник по справочным методам анализа почвы. Лондон, Нью-Йорк, Вашингтон: CRC Press Boca Ratan; 1999.[Google Академия] 15. Кант С., Би Ю.М., Ротштейн С. Понимание реакции растений на ограничение азота для повышения эффективности использования азота сельскохозяйственными культурами. J Опытный бот. 2011;62:1499–1509. doi: 10.1093/jxb/erq297. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Kendziorek M, Pazkoswski A, Zagdanska B. Дифференциальная регуляция гомологов аланинаминотрансферазы абиотическими стрессами в проростках пшеницы ( Triticum aestivum L.). Отчет о растительных клетках, 2012 г.; 31:1105–1117. doi: 10.1007/s00299-012-1231-2.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17. Кусано М., Фукусима А., Редестиг Х., Сайто К. Метаболомические подходы к пониманию метаболизма азота в растениях. J Опытный бот. 2011;62:1439–1453. doi: 10.1093/jxb/erq417. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Li JI, Zhu S, Song X, Shen Y, Chen H, Yu J, Yi K, Liu Y, Karplus VJ, Wu P, Deng XW. Ген, подобный рецептору глутамата риса, имеет решающее значение для деления и выживания отдельных клеток в апикальной меристеме корня. Растительная клетка. 2006;18(2):340–349.doi: 10.1105/tpc.105.037713. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Li X, Zeng R, Liao H. Повышение эффективности питательных веществ сельскохозяйственных культур за счет модификации структуры корней. J Integr Plant Biol. 2016;58(3):193–202. doi: 10.1111/jipb.12434. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 20. Mc Allister CH, Facette M, Holt A, Good AG. Анализ ферментативных свойств широкого семейства аланинаминотрансфераз. PloS Один. 2013;8(2):e55032. doi: 10.1371/journal.pone.0055032. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21.Миллер А.Дж., Фан Х, Орсел М., Смит С.Дж., Уэллс Д.М. Нитраты и сигнализация. J Опытный бот. 2007; 58: 2297–2306. doi: 10.1093/jxb/erm066. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Мосье А., Сайерс Дж. К., Френи Дж. Р. Сельское хозяйство и круговорот азота. Оценка воздействия использования удобрений на производство продуктов питания и окружающую среду. Вашингтон, округ Колумбия: ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ; 2004. с. 65. [Google Академия]23. Мурасиге Т., Скуг Ф. Пересмотренная среда для быстрого роста и биоанализа с культурой ткани табака. Завод Физиол. 1962; 15: 473–497. дои: 10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 24. Paine JA, Shipton CA, Chaggar S, Howells RM, Kennedy MK, Vernon G, Wright SY, Hinchliffe E, Adam JL, Silverstone AL, Drake R. Повышение питательной ценности золотого риса за счет увеличения содержания провитамина a. Нац биотехнолог. 2005; 23: 482–487. doi: 10.1038/nbt1082. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Ренч Д., Шмидт С., Тегедер М. Транспортер для поглощения и распределения органических соединений азота в растениях. ФЭБС лат. 2007; 581: 2281–2289.doi: 10.1016/j.febslet.2007.04.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Роча М., Содек Л., Ликаузи Ф., Хамид М.В., Дорнелас М.С., Ван Донген Дж.Т. Анализ аланинаминотрансферазы в различных органах сои Glycine max и в зависимости от различных азотных удобрений при гипоксическом стрессе. Аминокислота. 2010;39:1043–1053. doi: 10.1007/s00726-010-0596-1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Селварадж Майкл Гомес, Валенсия Милтон Орландо, Огава Сатоши, Лу Инчжи, Ву Лиин, Даунс Кристофер, Скиннер Уэйн, Лу Чжунджин, Кридл Джин С. , Ишитани Манабу, ван Бокстель Джос. Разработка и полевые испытания эффективных линий риса с использованием азота для Африки. Журнал биотехнологии растений. 2017;15(6):775–787. doi: 10.1111/pbi.12675. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Шрават А.К., Кэррол Р.Т., ДеПау М., Тейлор Г.Дж., Гуд А.Г. Генная инженерия повышения эффективности использования азота в рисе за счет тканеспецифичной экспрессии аланинаминотрансферазы . Plant Biotechnol J. 2008; 6: 722–732. doi: 10.1111/j.1467-7652.2008.00351.х. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Сивагуру М.И., Пайк С., Гассманн В., Баскин Т.И. Алюминий быстро деполимеризует микротрубочки коры и деполяризует плазматическую мембрану: доказательство того, что эти реакции опосредованы глутаматным рецептором. Физиология клеток растений. 2003;44(7):667–675. doi: 10.1093/pcp/pcg094. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 30. Slamet-Loedin IH, Chadha-Mohanty P, Torrizo L. Трансформация, опосредованная Agrobacterium : трансформация риса. В: Генри Р.Дж., Фуртадо А., редакторы.Зерновые геномные: методы и протокол. Методы молекулярной биологии, Vol. 1099. Нью-Йорк: Спрингер; 2014. С. 261–271. [PubMed] [Google Scholar] 31. Танака А., Гарсия CV. Изучение взаимосвязи между кущением и поглощением азота растениями риса. J Почвенные науки Растительные питательные вещества. 1965; 11 (3): 31–37. doi: 10.1080/00380768.1965.10431161. [Перекрестная ссылка] [Академия Google] 32. Тилман Д., Фарджионе Дж., Вольф Б., Д’Антонио С., Добсон А., Ховарт Р., Шиндлер Д., Шлезингер В.Х., Симберлофф Д., Свакхамер Д. Прогнозирование глобальных экологических изменений, вызванных сельским хозяйством.Наука. 2001; 292: 281–284. doi: 10.1126/science.1057544. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Triadiati AA, Pratama S, Abdurachman Pertumbuhan dan efisiensi penggunaan азотная пада пади ( Oryza sativa L.) dengan pemberian pupuk urea yang berbeda. Дж Анат Физиол. 2012; 20:1–14. [Google Академия] 34. Триятмико К.Р., Дуэнас С., Цакирпалоглу Н. , Торризо Л., Аринес Ф.М., Адева С., Балиндонг Дж., Олива Н., Сапасап М.В., Борреро Дж., Рей Дж., Франсиско П., Нельсон А., Наканиши Х., Ломзи Э., Тако Э., Глан Р.П. , Стангулис Дж., Моханти П.С., Джонсон А.Т., Томе Дж., Барри Г., Сламет-Лойдин И.Х.Биообогащенный рис индика достигает целевых показателей содержания железа и цинка в полевых условиях. Научный доклад 2016; 6:19792. doi: 10.1038/srep19792. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]35. Триятмико К.Р., Олива Н., Сламет-Лойдин И.Х., Кохли А. Молекулярный анализ трансгенных растений. Методы Мол Биол. 2016;1385:201–222. doi: 10.1007/978-1-4939-3289-4_15. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 36. Вальх-Лю П.И., Лю Л.Х., Реманс Т., Тестер М., Форде Б.Г. Доказательства того, что L-глутамат может действовать как экзогенный сигнал для модуляции роста и ветвления корней у Arabidopsis thaliana .Физиология клеток растений. 2006;47(8):1045–1057. doi: 10.1093/pcp/pcj075. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 37. Wang J, Dun X, Shi J, Wang X, Liu G, Wang H.