Листовертка насекомое: Листовертка: как бороться на Supersadovnik.ru

Содержание

Листовертка двулетняя | справочник Пестициды.ru

Сводные данные
Благоприятная t (^оC)	+20 + 25
Мин. t развития (^оC)	+15 +16
Плодовитость (шт)	30-100
Генераций в год	2
Яйцо (мм)	До 1
Личинка (мм)	1,5-14
Куколка (мм)	7-8
Размах крыльев (мм)	12 -15

Морфология

Имаго.

Бабочка. Размах крыльев – 12–15 мм. Передние крылья блестяще-соломенные с сильно расширяющейся в направлении переднего края поперечной перевязью темно-бурого цвета со свинцовым окаймлением по сторонам. Задние крылья светло-серо-буроватые.^[2]

Половой диморфизм. Разнополые особи отличаются строением гениталий.^[7]

Яйцо удлинено-овальное, приплюснутое. Длина – до 1 мм. Цвет бледно-зеленый. Прозрачное. Отложенное на листе или незрелой ягоде винограда, от просвечивающего хлорофилла кажется зеленоватым, позднее покрывается оранжевыми пятнышками.^[2]

Личинка (гусеница) в начале развития длиной 1,5–2 мм, светло-серого цвета с красноватой продольной полоской на спине. Голова, переднегрудной щит и грудные ноги гусеницы первого возраста черные. После первой линьки личинка становится красно-бурой. Докормившаяся гусеница достигает размера 12–14 мм. Окраска карминно-красная, с фиолетовым отливом; имеются большие коричневые щитки хет.

Голова, переднегрудной щит и грудные ноги гусеницы последнего возраста темно-бурые либо блестяще-черные, анальный щит коричневого цвета. Брюшные ноги оборудованы одноярусным венцом из 25–30 коготков, анальные – 15 коготками в медиальной подкове.^[2]

Куколка. Длина – 7–8 мм. Цвет покровов светло-коричневый. Вершина брюшка плавно закруглена. На ней расположены два направленных на спинную сторону сильно хитинизированных когтевидных выступа и десять крючковидных щетинок.^[2]

Фенология развития (в сутках)
Превращение	Полное
Полный цикл	6-10
Яйцо (эмбрион)	6-10
Личинка	15-24
Куколка	10 -14 суток, 10-11 месяцев

Развитие

Имаго. Весной, при установлении среднесуточной температуры 15–16°C, наблюдается дружный вылет бабочек из перезимовавших куколок.^[2]

Отрождение и вылет второго поколения бабочек происходит в конце июня – в июле.^[6]

Период спаривания. Оплодотворенные самки первого поколения размещают яйца поодиночке на бутонах, прицветниках, цветоножках, реже на молодых побегах виноградных кустов. Второе поколение откладывает их также по одному, но на незрелых ягодах винограда. Плодовитость самок – от 30 до 100 яиц.

[2]

Яйцо. Эмбриональное развитие длится 8–10 суток при температуре 15–20°C и 6–7 дней – при температуре 20–25°C.^[2]

Личинка (гусеница) первого поколения уничтожает цветоножки и содержимое бутонов, позднее переходит на питание цветками и завязями. При этом личинки плотно опутывают их паутиной, сплетая своеобразные гнезда. На одном соцветии может насчитываться три-четыре подобных гнезда – при таком количестве гнезд соцветие уничтожается полностью. Иногда гусеницы вбуравливаются в основание молодого побега или ножку соцветия, отчего побег увядает и засыхает. Личинки первой генерации развиваются в течение 15–24 суток. Докормившись, они окукливаются среди усохших частей соцветия. Иногда они уходят из мест питания и плетут коконы на листьях, побегах и коре ствола.

Гусеницы второй генерации прогрызают в ягодах круглые отверстия, проникают внутрь и поедают мякоть и незатвердевшие семена. За время питания одна личинка повреждает 9–12 ягод, при этом она скрепляет их между собой редкой паутинкой. Каждый раз в новой ягоде гусеница плетет паутинную трубочку, в которой и размещается. К концу августа докормившиеся личинки второй генерации покидают места питания, уходят в укромные места и через две недели превращаются в куколок.^[2]

Куколка. Куколка первого летнего поколения развивается за 10–14 суток, куколка второго зимует в плотном веретеновидном коконе в развилках побегов, среди остатков подвязочного материала, в трещинах и под отставшей корой виноградных кустов. ^[2]

Имаго. Весной бабочки дружно вылетают при установлении среднесуточной температуры 15–16°C. На юге Украины лёт первого поколения наблюдается во второй- третьей декаде мая. За сезон развиваются две генерации.

[2]

Морфологически близкие виды

По морфологии имаго к описываемому виду близка Eupoecilia angustana. Она отличается тем, что внешнее поле ее переднего крыла ограничено бурой или коричневой полосой. В срединном поле располагается бурая или красновато-бурая полоса. Переднее крыло вдоль дорсального края с рядом черных точек.^[8]

Кроме описанного вида, часто встречается Вертунья почковая (Spilonota ocellana), также сходная по внешнему виду имаго с Двулетней листоверткой (Eupoecilia ambiguella).^[3]

Географическое распространение

Ареал распространения листовертки двулетней охватывает всю Западную и Восточную Европу, кроме Крайнего Севера, Кавказ, Среднюю Азию, Западную Сибирь, Амурскую область, Приморский и Хабаровский край, а также остров Сахалин.

Кроме того, вредитель распространен в Передней Азии, Северной Индии, Японии и на Тайване.^[2]

Вредоносность

Двулетняя листовертка сильно повреждает виноградники. Кроме того, к кормовым растениям данного вредителя относятся смородина, кизил, жимолость, терн, бузина, калина, бересклет, крушина, сирень, бирючина, клен, китайский лимонник, амурский виноград. Вредят гусеницы.Первое поколение питается бутонами соцветий, второе – ягодами. Остатки поврежденных ягод засыхают, а при влажной погоде заражаются гнилостными бактериями и плесенью.^[2]

Пестициды

Химические пестициды:

Для опрыскивания в процессе вегетации:

Инсектицид широкого спектра действия:

В личных подсобных хозяйствах:

Биологические пестициды:

В личных подсобных хозяйствах:^[5]

Меры борьбы

Химический способ.

Своевременное опрыскивание кормовых растений фосфорорганическими соединениями, неоникотиноидами, пиретроидами, ингибиторами синтеза хитина и прочими веществами. ^[4]

Биологический способ борьбы. Опрыскивание кормовых растений биологическими пестицидами.^[4]

Название вида и синонимы представлены согласно:^[1]^[9]

При написании статьи также использовались следующие источники:^[1]^[9]

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Литературные источники:

Афонин А.Н.; Грин С.Л.; Дзюбенко Н.И.; Фролов А.Н. (ред.) Агроэкологический атлас России и сопредельных стран: экономически значимые растения, их вредители, болезни и сорные растения [Интернет-версия 2.0]. 2008

Васильев В.П. Вредители сельскохозяйственных культур и лесных насаждений: В 3-х т. — Т. 2. Вредные членистоногие, позвоночные. — 2-е изд., испр. и доп. / Под общ.

ред. В. П. Васильева; Ред-ры тома В.Г. Долин, В.Н. Стовбчатый.— К.: Урожай, 1988 576.; ил. ОК

Великань В.С., Определитель вредных и полезных насекомых и клещей плодовых и ягодных культур в СССР. / В.С.Великань, А.М.Гегечкори, В.Б.Голу: Сост. Л.М.Копанева. — Колос. Ленинградское отделение, 1984.- 288 с., ил.

Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2012 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России)

Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, 2016 год. Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России) &nbsp

Скачать >>>

Козарь И.М. Болезни и вредители винограда. Меры борьбы. – Одесса: Национальный научный центр «Институт винорадарства и виноделия им. В.Е. Таирова», 2005. – 65 с.

Лер П.А. Определитель насекомых Дальнего Востока России в шести томах. Т. V. Pучейники и чешуекрылые Ч. 3. под редакцией П.А. Лера, Владивосток: Дальнаука, 2001 , 621 с

Скарлато О.А. Определитель насекомых европейской части СССР. Том IV. Чешуекрылые. Первая часть. А.К. Загуляев, В.И. Кузнецов, А.А. Стекольников И.Л. Сухарева, М.И. Фалькович. Л., « Наука», 1978 г, 712 с.

Стриганова Б. Р., Захаров А. А. Пятиязычный словарь названий животных: Насекомые. Латинский-русский-английский-немецкий-французский. — М.: РУССО, 2000. — 560 с.

Изображения (переработаны):

10.11. Свернуть Список всех источников

Листовертка подкоровая | справочник Пестициды.ru

Сводные данные
Генераций в год	1
Яйцо (мм)	1
Личинка (мм)	11-14
Куколка (мм)	7-8
Размах крыльев (мм)	15-18

Морфология

Имаго. Бабочка с размахом крыльев 15–18 мм. Передние крылья имеют сложный рисунок из чередующихся пятен и полос, которые состоят из темно-бурых, оранжево-желтых и металлически блестящих чешуек. На переднем крае крыла семь ярких желтовато-белых костальных штрихов. От пятого штриха от вершины крыла к внешнему краю отходит дважды изогнутая, длинная полоса металлического цвета с синим отливом. Подобные, но немного укороченные полосы отделяются от шестого и седьмого костальных штрихов. У середины внутреннего края имеется дорсальное пятно оранжевого цвета, заполненное внутри свинцово блестящими чешуйками. Над торнальным углом расположено крупное «зеркальце» круглой формы, окаймленное тонким ободком оранжевого цвета. Зеркальце образовано двумя широкими поперечными металлически блестящими линиями и правильно чередующимися между ними продольными полосами оранжевого и темно-бурого цвета. Сразу над зеркальцем, немного ближе к середине крыла – оранжевое глазчатое пятнышко с металлически блестящими чешуйками. Задние крылья бурого цвета.^[2]

Половой диморфизм. Разнополые особи листовертки подкоровой отличаются строением половых органов.^[6]

Яйцо плоское, округлое. Диаметр около 1 мм. Цвет покровов сначала розовый, потом – красно-розовый.^[2]

Личинка (гусеница) червеобразная. Длина – 11–14 мм. Матовая, полупрозрачная, парафиново-белого цвета с грязновато-серым оттенком. Его телу гусеницы придают многочисленные субмикроскопические шипы темно-бурого цвета. Щитки хет тела крупноватые, светло-серые, слегка выпуклые. Длина хет умеренная. Голова медово-желтого цвета, покрыта пятнами немного темнее основного тона. Щечные и глазные пятна маленькие, темно-коричневого цвета, почти черные. Анальный и переднегрудной щиты слабо склеротизованные, светло-буро-серого цвета, анальный щит сплошь покрыт темно-бурыми пятнами. Грудные ноги имеют трехъярусный венец из 34–41 коготка, анальные – трехъярусную медиальную подкову из 18–21 коготков. ^[2]

Куколка, как и у всего семейства листоверток, относитсяк примитивному типунеполных, поскольку выдвигается из кокона при выходе бабочки. У самок подвижны 4–6-й, а у самцов – 4–7-й брюшные сегменты. Длина куколки листовертки подкоровой (вишневой) – 7–8 мм. Цвет тела медово-желтый, глаза черные. Кремастер выглядит как небольшая заостренная пирамидка, оборудованная четырьмя крючковидными щетинками, располагающимися на вершине в ряд. По две подобных щетинки имеется и по бокам кремастера. Голова куколки закругленная, без выступов.^[2]

Фенология развития (в сутках)
Превращение	Полное
Полный цикл	1 год
Личинка	8-10 месяцев
Куколка	10-21

Развитие

Имаго. Лёт бабочек наблюдается с конца апреля до конца августа.^[2]

Период спаривания растянут. Самка откладывает яйца на уровне не выше 50–70 см от поверхности почвы в щели коры, а также в места ранений и предыдущих повреждений гусеницами этого же вида на толстых ветвях, штамбах и на главных корнях, расположенных над поверхностью почвы.^[2]

Яйцо по мере развития становится красно-розовым.^[2]

Личинка (гусеница) после отрождения пробирается под кору и прокладывает там ходы. С наступлением похолодания гусеницы впадают в диапаузу до весны; весной личинки просыпаются и продолжают вредить. Питаются лубом и заболонью.^[2]

Куколка. Окукливается вредитель под корой в колыбельках, оклеенных буровой мукой и экскрементами. Стадия куколки весной длится 2–3 недели, летом – 10–12 дней.^[2]

Имаго. Окукливание гусениц и вылет бабочек сильно растянуты. Эти процессы можно наблюдать почти в течение всего вегетационного периода – с апреля по август. Поэтому, несмотря на то, что в году у листовертки подкоровой развивается только одно поколение, в течение вегетационного периода можно наблюдать все стадии развития насекомого практически одновременно.^[2]

Морфологически близкие виды

По внешнему виду (морфологии) имаго к описываемому виду близка Enarmonia minuscule. Встречается на Корейском полуострове и Японских островах. Прикорневое поле переднего крыла с желтой поперечной струйчатостью. Рисунок такой же, как у Подкорковой листовертки, но без оранжевого тона. Ункус самца короткий.^[5]

Кроме данного вида, в Японии, на острове Хонсю, встречается Enarmonia décor, также сходная по морфологическим признакам с Листоверткой подкоровой (вишневой).^[5]

Географическое распространение

Ареал распространения листовертки подкоровой охватывает Западный Казахстан, Зауралье, Южное Приморье, Восточную Европу, Западную Европу – от Великобритании и Скандинавии до Средиземного моря. Кроме того, к местам обитания вредителя относятся Северная Африка и Малая Азия.^[7] Завезен в Северную Америку.^[5]

Вредоносность

Листовертка подкоровая повреждает заболонь, кору и камбий на стадии гусеницы. От воздействия насекомого страдают абрикосы, персик, вишня, черешня, алыча, магалебская вишня (антипка), слива, миндаль, гораздо реже яблоня и груша. Особенно сильно повреждается нижняя часть штамба и корневая шейка ниже уровня поверхности земли.^[6]

Поврежденные деревья болеют, отстают в росте и плохо плодоносят. При большой численности вредителя происходит усыхание скелетных ветвей. Иногда вследствие кольцевого повреждения подкорных тканей ствола гибнет все дерево.^[2]

Пестициды

Химические пестициды:

Опрыскивание в период вегетации:

В личных подсобных хозяйствах:

Биологические пестициды:

В личных подсобных хозяйствах:^[4]

Меры борьбы

Механический способ. Практикуется очистка стволов от верхнего отмершего слоя коры, с последующим сжиганием очисток, вылавливание бабочек при помощи феромонных ловушек и светоловушек. В приусадебных участках можно уничтожать гусениц, срезая их с коры.^[6]

Химический способ. Своевременное опрыскивание поврежденных стволов и корневой шейки деревьев фосфорорганическими соединениями, пиретроидами, минеральными маслами.^[3]

Биологический способ борьбы. Опрыскивание деревьев биологическими пестицидами.^[3]

При написании статьи также использовались следующие источники:^[8][1]

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Литературные источники:

Ванек Г., Корчагин В.Н., Тер-Симонян Л.Г. Атлас болезней и вредителей плодовых, ягодных, овощных культур и винограда. Братислава.–М. Природа. Агропромиздат. 1989 г. 413 с., илл.

Васильев В.П. Вредители сельскохозяйственных культур и лесных насаждений: В 3-х т. — Т. 2. Вредные членистоногие, позвоночные. — 2-е изд., испр. и доп. / Под общ. ред. В. П. Васильева; Ред-ры тома В.Г. Долин, В.Н. Стовбчатый.— К.: Урожай, 1988 576.; ил. ОК

Савковский П.П., Атлас вредителей плодовых и ягодных культур, К. «Урожай», 1990. –с.90

Изображения (переработаны):

9.10. Свернуть Список всех источников

чем обработать? Гусеницы на груше, яблоне и на смородине. Гроздевая виноградная листовертка, зеленая дубовая и другие виды

Летний сезон на многих дачах начинается с вредителей, которые съедают культурные растения. К таким относятся листовёртки, принадлежащие к семейству бабочек. Гусеница – один из жизненных этапов. Именно в этой стадии насекомое и приносит беды дачникам.

Виды и описание вредителя

В природе из всего семейства листовёрток наиболее живучими и распространёнными являются только два рода: плодожорки и побеговьюны. Как нетрудно догадаться по названию, первый род питается преимущественно листьями плодовых деревьев или кустарников. Второй же обитает на побегах в основном хвойных деревьев. Другие разновидности не так распространены, хотя они могут питаться всем растением: от корней, находящихся под землёй, до надземных листьев и стеблей.

Для дач наибольшие проблемы доставляют именно плодожорки. В свою очередь, данный род также имеет разделение на множество разных видов. Они отличаются местом обитания и своей основной пищей. У них присутствуют некоторые различия во внешнем виде, однако можно выделить некоторые черты, которые присущи всем.

Так, гусеницы листовёртки – это не очень большие насекомые. Их длина варьируется от 10 до 20 мм, цвет тела может быть зелёным или тёмно-жёлтым, а голова – бурой или чёрной.

Листовёртка на яблоне

Яблоня является плодовым деревом, она очень любима данным вредителем. На ней может обитать большое количество разных гусениц листовёртки.

Почковая листовёртка. По-другому она называется вертуньей. Её личинка имеет достаточно маленький размер – всего 9-11 мм. Цвет тела может быть серым и коричневым или их смешением. Голова же в основном чёрная, как и грудь. Помимо яблони, обитает на многих других плодовых деревьях, таких, как груша, абрикос, вишня и т. д.
Гроздевая листовёртка. Название получила из-за ареала своего обитания. Как правило, встречается она на кустовых растениях, плоды которых растут гроздьями. Но листьями яблони гусеница такой бабочки полакомиться тоже не против. Длина её тельца составляет около 11 мм. Раскраска же преимущественно жёлтая, зачастую с серыми оттенками, а цвет головы – светло-коричневый.
Восточная плодожорка. Одна из самых опасных для урожая гусениц. Она отличается от других тем, что цвет её туловища очень светлый: он может быть белым, бежевым и немного розоватым. Выделяется же на ней голова и грудное отделение. Их цвет тёмный, зачастую просто чёрный. Такая гусеница обитает не только на яблоне, но также на персике и груше.
Боярышниковая листовёртка. Личинка этой бабочки поселяется не только на дачных деревьях – яблоне, сливе, вишне – но и на диких лесных, таких, как клён, дуб, липа. У данного вида велико разнообразие цветов тела. Они варьируются в оттенках чёрного и серого. Так, окрас может быть как светло-серым, так и полностью чёрным. А размеры данной гусеницы составляют в среднем 22 мм в длину, что достаточно много.
Яблоневая листовёртка. Другое её название – яблочная плодожорка. Его она получила именно за то, что чаще всего встречается именно на яблонях. Однако, это насекомое может питаться и листьями груши, а иногда его можно встретить даже на берёзе. Одной из особенностей данной листовёртки является её пристрастие к наиболее сладким сортам яблонь и груш. На деревьях с кислыми плодами она встречается реже. Узнать её можно по характерным точкам на жёлто-зелёном теле. Причём каждая такая точка – это маленькая щетинка. Голова, как правило, имеет коричневый окрас.

Такие гусеницы чаще всего встречаются на листьях яблони. Помимо них, можно встретить и другие виды, например, сливовую, смородинную и т. д. Но, безусловно, основной вредитель яблонь из всех видов листовёртки – это яблочная плодожорка.

Листовёртка на груше

Груша так же, как и яблоня, является очень распространённым местом обитания гусениц листовёрток. Из-за этого они имеют общих вредителей, которые водятся на листьях и одного, и другого дерева. Однако, груша имеет и своих гусениц, обитающих в основном на ней.

Грушевая листовёртка. Является неким аналогом яблоневой плодожорки. Бабочки откладывают яйца именно внутрь плода, причём их выбор в большинстве своём падает на летние сорта. Всё дело в тонкой кожуре летних плодов, что позволяет бабочкам легче оставлять там кладку. Гусеница растёт, питаясь грушей, после чего вылезает наружу, а плод оставляет досыхать. По внешнему виду эта листовёртка не очень выделяется. Длина её тела может достигать 11 мм, а его окрас в основном белый, но не очень яркий. Голова же обычно тёмно- или буро-жёлтая.
Дубовая листовёртка. Несмотря на то, что название говорит об ареале обитания в виде дуба, такая листовёртка нередко встречается и на груше. Благодаря её окрасу она получила и другое наименование – зелёная листовёртка. Голова тёмная, а длина тела не превышает 18 мм.

Зачастую эти вредители повреждают молодые побеги грушевого дерева – почки. Происходит это весной, и если не предпринять мер, садовод может остаться без урожая на целый год.

Листовёртка на сливе

Слива – благоприятное место для множества видов листовёрток. На ней обитает большинство вредителей, присущих груше и яблоне. Кроме них имеются и ещё два вида, которые также можно встретить на данном плодовом дереве.

Сливовая листовёртка. По совместительству является и плодожоркой, то есть обитает в плодах. Гусеница живёт за счёт питательных веществ сливы, съедая, как правило, мякоть в зрелых плодах и косточку в молодых. Длина тела составляет от 12 до 15 мм, а цвет меняется в течение её роста от белого до розоватого или красного.
Плодовая листовёртка. Ничем не выделяющийся вид, живущий не только на сливе, но и на различных кустарниках. Однако размер тела этой гусеницы довольно большой – он может достигать 20 мм. Окрас – один из оттенков зелёного, например, оливковый или тёмно-зелёный.

Листовёртка на абрикосе и персике

Абрикос и персик менее распространены в целом по России и Европе, но часто встречаются в районах с благоприятным климатом. Данные деревья не имеют каких-либо вредителей, присущих только им. Однако листовёрткой они всё равно поражаются. В основном это яблоневые, грушевые и сливовые листовёртки, но иногда встречаются и гроздевые или смородинные.

Листовёртка на винограде

Не только деревья являются местом обитания вредителей, но и кустарники тоже. Среди них есть и виноград, причём помимо распространённой гроздевой листовёртки на нём может поселиться виноградная и двулетняя.

Виноградная листовёртка. Главной её особенностью является большая длина зрелых гусениц – она может достигать 3 см. Живут они на винограде, питаясь сначала почками, а затем, после того как чуть-чуть подрастают, листьями. Из внешних признаков можно отметить серо-зелёный окрас туловища и бурую голову.
Двулетняя листовёртка. Распространена по всему континенту. Поедает не только плодовые кустарники, среди которых и виноград, но и кормовые растения. В них гусеница питается бутонами и цветками, тем самым повреждая их. Окрас тела взрослой личинки красный, с фиолетовыми проблесками, а цвет головы и грудного щитка чёрный или коричневый. Размеры же её достигают 15 мм в длину.

Вредители такого типа создают себе убежища в листьях кустарника, заворачивая их в трубочку. Если потревожить отдыхающую в таком домике гусеницу, то можно увидеть, как она резво начнёт спускаться по паутине на землю.

Листовёртка на смородине

Главным вредителем является смородинная или смородиновая листовёртка. Гусеница этой бабочки по своему поведению очень похожа на виноградных вредителей. Она так же поедает почки и листья растения, создавая при этом в них свои убежища. Длина её составляет от 16 до 20 мм, а окрас – зелёный, с оттенками жёлтого или серого. Данная листовёртка обладает очень высокой плодовитостью, поэтому зачастую личинки этого насекомого наносят большой ущерб садоводам.

Листовёртки на малине

В целом малина не так сильно подвержена повреждениям от листовёрток. Особенно это заметно, если сравнивать со смородиной или виноградом. Но всё же и на этом растении присутствуют личинки данных насекомых. В основном на малине встречаются следующие виды.

Листовёртка заморозковая. Её можно встретить и на яблоне, и на груше, и на малине. Особых отличий её личинка не имеет, но примечателен её окрас: само тело светло-зелёное, но присутствует пара ещё более светлых полос на спине. Размер её составляет около 16 мм.
Листовёртка сетчатая. Её личинка является достаточно большим насекомым, так как в длину достигает более 2-х см. Окраска гусеницы может сильно различаться у разных особей. В основном она представлена зелёным цветом, оттенки которого могут быть как светлые, так и тёмные. Помимо малины, данное насекомое встречается на других кустарниках, а также на плодовых деревьях.

Листовёртка на розах

Поселение листовёрток возможно не только на плодовых растениях, но и на цветковых. К ним относятся розы, на чьих листьях очень часто можно заметить гусениц. В основном это розанная разновидность. Гусеница этого насекомого достаточно распространена на огромном количестве плодовых деревьев и кустарников, а также на декоративных растениях. Обычно её тело зеленого цвета, а размеры варьируются от 18 до 20 мм. Поедает она в растении не только почки и листья, но ещё и бутоны. В период зрелости личинка начинает, подобно вредителям винограда и смородины, закручиваться в листья.

Листовёртка на других растениях

Гусениц можно встретить и на помидорах. Как правило, они носят название помидорные совки. Размер гусеницы достигает 3 см, откуда следует вывод, что это одна из самых больших личинок в роду. Выглядит она достаточно устрашающе. Они приносят вред как листьям растения, так и самим томатам. На хвойных деревьях иногда можно увидеть лиственничных листовёрток. Питаются они самой хвоей, а иногда в их рацион питания добавляются внутренности шишек.

К вредителям лиственных деревьев, например, дуба, относится зелёная дубовая листовёртка. Селится она практически только на дубе и может достигать в длину 2 см. На клёне встречается одноимённый вредитель, который обитает только на этом дереве. Черешню повреждает подкоровой вид, который может встретиться также на яблоне, груше и иногда сливе. Злаковые культуры, такие, как пшеница или рожь, повреждает одноимённый вредитель. Земляникой питаются болотные совки и земляничные листовёртки.

Признаки возникновения

Присутствие гусениц-вредителей можно понять по наличию характерных признаков изменения растений.

На листьях начинают появляться неестественные пятна. Это происходит из-за повреждения сосудов растений насекомыми.
Засыхание листьев, плодов, цветков. Как правило, личинка питается одной или несколькими частями растений. Это приводит к тому, что рано или поздно то, чем питаются насекомые, начинает отмирать и засыхать.
Появление некой паутины на растении – явный признак присутствия гусениц листовёртки. Паутина помогает личинкам удобнее перемещаться по растению, создавать убежища и окукливаться.
Загибание листьев. Следствие того, что гусеницы создают себе «домики», путём закручивания в листья.

Методы борьбы

После того, как садовод окончательно убедился, что в его огороде завелись насекомые-вредители, ему стоит принять меры по их выведению. Причём лучше заняться этим как можно раньше. Всё из-за того, что личинок легче уничтожить, чем бабочек. Существует множество методов борьбы с ними.

Если обобщить, то можно все способы объединить в четыре группы: биологические, химические, механические и народные.

Химические

Данный метод заключается в использовании отравы на основе ядохимикатов. В большинстве своём они являются покупными, так как для их изготовления требуются такие химические элементы, которые трудно достать обычному человеку. Все препараты делятся на системные и контактные. Суть контактных средств заключается в относительной безопасности их использования. Это значит, что, применяя такие препараты, чтобы избавиться от листовёрток, человек не подвергается никакому риску.

Однако и эффективность их довольно низкая. Контактные средства подойдут в тех случаях, когда вредителей на участке не очень много. Системные же препараты являются некой «тяжёлой артиллерией». Они очень эффективны, особенно хорошо виден результат их работы при высокой численности листовёртки. Но главным их минусом является высокая опасность применения. Они являются токсичными не только для насекомых, но и для человека.

Стоимость системных химических средств, как правило, выше, чем стоимость контактных.

Наиболее популярными являются контактные препараты от следующих производителей:

«Алатар»;
«Карбофос»;
«Дурсбан»;
«Атом»;
«Актара»;
«Актеллик».

Листовёртки – довольно живучие насекомые, поэтому для их истребления вышеперечисленными средствами придётся подождать некоторое время. Причём использовать их стоит несколько раз с паузой в 1 или 1,5 недели.

Обработать растения можно следующими системными химикатами:

«Айвенго»;
«Альфацин»;
«Фатрин»;
«Фастак»;
«Аккорд».

Они способны вывести любой вид листовёрток, но использовать их стоит с большой осторожностью, так как они очень токсичны для человека. Обрабатывать ядохимикатами следует точно по инструкции, однако в большинстве своём они способны истреблять насекомых не только весной, но и летом, и осенью.

Биологические

Бороться с насекомыми можно с помощью тех, кто в природе ими питается. Это могут быть обычные птицы. Для листовёрток самым неприятным врагом будет синица. Она поедает не только гусениц, но и бабочек. Лучшее средство для привлечения птиц на свой участок – это кормушки. Делать и развешивать их стоит по осени – тогда велик шанс того, что уже весной можно будет заметить результат этого метода. Однако у биологических способов есть недостаток – птицы могут съедать вместе с насекомыми часть урожая. Поэтому, действуя таким образом, нужно быть внимательным и не перебарщивать.

Народные

Проблема наличия вредителей на огородах появилась у человека давно, а вот современные решения – недавно. Из-за этого люди сейчас имеют огромный опыт в борьбе с листовёртками с помощью народных средств. Их отличительной чертой является то, что данные методы в большинстве своём безопасны для человека и растений. Также можно отметить их дешевизну – вещества, из которых делаются отравы, зачастую даже не нужно покупать.

Итак, вот несколько эффективных отваров, которые можно сделать своими руками.

Отвар полыни. Для его приготовления потребуется высушенная полынь и вода. Вместо сухого варианта можно использовать и свежую траву, но в таком случае её стоит хорошо измельчить. Этот ингредиент добавляется в воду и настаивается в течение нескольких суток. После этого отвар кипятится около 30 минут. С помощью воды объём средства доводят до первоначального, а перед использованием снова разбавляют в отношении 1: 1.
Настой табака. В ведро, наполненное горячей водой, нужно добавить 0,5 кг махорки или пыли табака. Затем нужно дать ему настояться около двух дней и процедить через марлю. Перед обработкой препарат нужно развести водой 1: 1 и добавить 40 г обычного мыла. Данный отвар является токсичным для человека, поэтому стоит использовать средства защиты при его применении.
Отвар ботвы помидоров. Способ его приготовления очень схож с готовкой отвара полыни. Для него потребуется мелко нарезать корни и ботву помидоров и добавить их в ведро воды. Им дают настояться 4 часа, а затем на маленьком огне кипятят 30 минут. Препаратом будет являться сама жидкость, поэтому её следует снова процедить, а ботву отжать и выкинуть. Хранится данное средство в стеклянных банках в прохладных местах. Перед применением оно разводится и к нему добавляется натёртый небольшой кусочек мыла.

Механические

Лечение растений от листовёрток можно проводить и механическим путём: собирать гусениц вручную и уничтожать их. Это операция похожа на выведение колорадского жука. Механическое «лекарство» хорошо на первых стадиях, как только нежелательные насекомые были замечены. Иногда их популяция не слишком велика, и такой метод вполне может быть рабочим.

Меры профилактики

Профилактические методы весьма просты. Листовёртки селятся на слабых или больных деревьях и растениях. Поэтому стоит не допускать этого на своём участке. За каждым растением нужно пристально следить.

Кустарниковые достаточно вовремя полоть, а также при необходимости подпитывать и поливать. Но нужно помнить, что избыток минеральных веществ так же плох, как и их недостаток.
Плодовые и неплодовые деревья, находящиеся в вашем владении, стоит обстригать во избежание очень плотной кроны.
Также можно применять и некоторые химические препараты, созданные специально для профилактических обработок.

Наличие популяции листовёртки на участке может привести к гибели растений. Для выведения паразитов можно использовать многие средства, однако лучше не допускать их появления и проводить профилактические мероприятия.

В следующем видео вас ждет защита винограда от гроздевой листовертки.

Листовертки — маленькие, но опасные вредители

Летний сезон в самом разгаре. На земле трудятся все, кто имеет возможность и желание. Дачники на своих участках ухаживают за будущим урожаем. Сельскохозяйственные предприятия трудятся на благо всей страны. Хороший урожай зависит от многих факторов, в том числе от отсутствия вредителей.

Листовертки – одно из наиболее обширных по количеству видов семейств чешуекрылых. Оно насчитывает более 11 365 видов в мировой фауне, многие из которых являются вредителями сельскохозяйственных, декоративных, садовых, парковых и лесных культур.

Большинство представителей семейства по типу питания полифаги и имеют большое разнообразие в выборе растения для питания. Личинки очень многоядны и могут нанести огромный ущерб сельскому хозяйству.

Яблоневая плодожорка (Cydia pomonella) — важнейший вредитель, причиняющий огромные убытки садоводству, лесо-садам и плодовым лесам. Повсеместно гусеницы уничтожают значительную, а иногда и большую часть урожая плодов семечковых культурных и дикорастущих растений яблонь, груш, айвы, на юге Европы, в Закавказье, Средней Азии и на юге США, а также абрикоса, персика и грецкогоореха. Реже повреждают сливу, гранат, изредка встречаются на апельсинах.

Восточная плодожорка (Grapholita molesta) – опасный вредитель почти всех плодовых культур. Повреждает плоды и побеги косточковых и семечковых культур: нектарина, персика, сливы, алычи, абрикоса, груши, яблони, вишни, миндаля, плоды боярышника. В течение сезона восточная плодожорка наиболее сильно повреждает молодые побеги, завязи и плоды растений, из-за чего прирост новых побегов отсутствует. C появлением плодов, гусеницы плодожорки переходят на них. Плоды при этом загнивают, становятся не пригодными.

Бороться с листоверткой можно тремя способами: химическим, механическим и биологическим. Благодаря механическим способам борьбы можно уничтожить гусениц данного вредителя либо создать препятствие, которое будет защищать участок вредителя. К таким методам относятся: обрезание и сжигание листвы свернутой вредителем, а еще стряхивание гусениц с растения. Также для того чтобы избавиться от вредного насекомого механическим путем, можно использовать разнообразные ловушки, которые предназначены не только для сбора, но и для уничтожения листоверток. Такие приспособления не наносят никакого вреда как животным, так и человеку, а еще они не загрязняют природу.

Биологические способы борьбы с таким насекомым предполагают использование для этого его естественных врагов. А точнее, на участок рекомендуется привлекать птиц. Главным врагом листоверток является синица. Она уничтожает как взрослых бабочек, так и гусениц. Для того чтобы ее не только привлечь на участок, но и удержать на нем, с осени на деревьях рекомендуется развесить кормушки, в которые кладутся нежареные семечки и несоленое сало.

Наибольшей эффективностью отличаются химические способы борьбы с вредителем, с помощью которых можно истребить как бабочек, так и их гусениц. Но в этом случае нужно учесть, что такой вредитель может очень быстро адаптироваться к токсинам, в связи с этим используемые для обработки препараты нужно регулярно заменять либо чередовать. Помимо этого токсины, входящие в состав химических средств, во время опрыскивания растения оказываются на поверхности плодов, и могут нанести вред при употреблении их в пищу.

Бороться с листоверткой нужно не только на тех растениях, на которых она была замечена. Следует обрабатывать все деревья и кустарники, потому что личинки такого насекомого с легкостью могут перебраться на другое растение, просто выскользнув из свернутой листвы. Помимо этого нельзя забывать о мерах профилактики, которые помогут защитить сад от появления этого вредителя. Чтобы своевременно начать борьбу с вредителем, нужно каждый день осматривать садовые культуры. Пока вредителей мало, избавиться от них намного проще.

Розанная листовертка на розах, методы борьбы, профилактика

Розанная листовертка – насекомое, которое живёт на листьях и побегах розы, питается тканью растения. Взрослая листовертка или имаго представляет собой желто-коричневую ночную бабочку конусовидной формы. Вредитель проживает на кусте розы несколько стадий, самая Опасная из которых является стадия гусеницы.

Как распознать розанную листовертку на розах

Розанная листовертка – некрупная бабочка от 15 до 20 мм в длину жёлтого цвета с коричневыми узорами. С июня по август вредители всупаби в период лета. Листовертки спариваются, перемещаются на розовые кусты и откладывают на них яйца.

Пик размножения розанных листоверток приходится на начало июля. Отложенные яйца зимуют на растении, в углублениях на побегах, в стыках веток, в морщинах коры. В течение зимы потомство накапливается энергию и растёт.

С наступлением весны листовертки переходят в новую, самую опасную стадию развития. В апреле при установлении температуры в +8 градусов начинают вылупляться гусеницы. Розанная листовертка на розе в стадии гусеницы окрашена в светлый зелёный оттенок, головка темно-коричневая.

Гусеница попадает в бутоны роз, где питается тычинками и пестиками, повреждает лепестки, из-за чего розы не расцветают.

Достигнув определённого возраста, листовертка готовится к окукливанию. Для этого она скручивает листья в виде трубки, похожей на сигару. Гусеница готовится к окукливанию от 20 до 40 дней. Куколка превращается в бабочку за одну-две недели. После новая бабочка вступает в период лета и откладывает новые яйца на розах.

Вред розанной листовертки для роз, последствия появления насекомых

Розанная листовертка опасна для розы в стадии гусеницы. Насекомое питается растением, повреждает бутоны и листья. В повреждениях начинается развитие грибковых заболеваний, например, серой гнили. Розы не распускаются из-за того, что гусеницы съедают тычинки.

Насекомое портит внешний вид розы, куст лишается декоративности. Листья скручиваются и покрываются паутиной. Кустарник выглядит неопрятно, повреждённые части растения высыхают, опадают листья. После бабочки вновь откладывают яйца, новое потомство будет повреждать куст на будущий год.

Причины появления розанной листовертки на розах

Розанная листовертка на розах активно размножается в условиях тёплой зимы. У насекомых больше шансов выжить в тёплую погоду, нежели в сильный мороз. Вредитель размножается не только в благоприятных погодных условиях, многие садоводы допускают типичные ошибки, из-за которых появляются паразиты:

Посадка розы в неудачное место. Чаще всего розанная листовертка появляется на ослабленных растениях. Розы борятся за свое выживание, их иммунитет ослабляется. Культуру нельзя сажать на сквозняке или в тени, розе нужно тёплое, солнечное место;
Недостаток питательных элементов. Кустарник не может противостоять вредителям, если ему недостаточно полезных веществ. Своевременная подкормка роз защитит их розанной листовертки и других насекомых, потому что растение станет сильным и крепким;
Повреждения на розах. Листовертки проникают в повреждённые части растения, где можно хранить кладки яиц или питаться соком растения. Необходимо регулярно осматривать розу на наличие повреждений, аккуратно обрезать куст острым, продезинфецированным инструментом.

Чтобы снизить риск распространения насекомых, требуется следовать правилам по уходу и обработке за розами. Осенью или весной нужно обрезать розу, удаляя все повреждённые побеги.

Меры борьбы с розанной листоверткой на розах, как избавиться от розанной листовертки

Небольшое количество насекомых можно убрать с кустарника вручную. Гусениц нужно снять с листьев и побегов и убрать их в ёмкость с водой. При обнаружении скрученных листьев-куколок, их необходимо убрать с растения. Чтобы избавиться от яиц или больших колоний насекомых, требуется применять специальные химические и биологические средства.

Инсектициды и биоинсектициды от розанной листовертки на розах

Сезар – мощный препарат, который убивает листовертку в течение 8 часов после применения. Окончательно насекомые погибают через 3 дня после начала опрыскивания розы;
Лепидоцид – биоинсектицид, в основе которого эффективная микрофлора. Специфический запах средства отпугивает бабочек в период лета;
Кораген – комплексный химический продукт для лечения заболеваний и уничтожения вредителей. Насекомые погибают за два дня использования;
Либер – эффективный системный инсектицид;
Конфидор Макси – системное средство, проникающее в ткани кустарника и поражающее вредителей, обосновавшихся внутри растения. Продукт действует после одного применения.

Народные методы от розанной листовертки на розах

Химические инсектициды от розанной листовертки на розах токсичны и опасны для здоровья и окружающей среды. Несмотря на то, что препараты действуют быстро и тотально, иногда лучше использовать народные методы, проверенные другими садоводами. Наиболее распространены и эффективны следующие средства на основе природных компонентов:

Настой полыни. 800 г полыни нужно мелко порубить и залить 10 л воды. Трава должна настаиваться в течение двух суток. После настой нужно вскипятить. Объем готового раствора должен составлять 10 л, поэтому нужно добавить недостаток воды;
Настой табака. 500 г пыли табака необходимо залить ведром воды. Табак нужно настаивать двое суток, процедить и добавить один кусок измельченного хозяйственного мыла. Настой должен быть однородным, им нужно сразу опрыскать растения;
Настой ботвы помидоров или картофеля. Овощную ботву можно настаивать по отдельности или вместе. 4 кг ботвы нужно настаивать 3-4 часа в 10 литрах воды. В готовом настое необходимо растворить 50 г хозяйственного мыла;
Настой чёрной белены. Делать средство нужно с осторожностью, потому что чёрная белена ядовита. Нужно взять 3 кг травы и залить водой. Белену необходимо кипятить 2 часа на слабом огне. Готовый раствор доливабт до 10 литров.

Профилактика розанной листовертки на розах

Заметить розанную листовертку на розе проще всего в весенний период, когда листья скручены в трубочку. Внутри скрученных листьев спрятаны яйца, уничтожить их опрыскиванием сложно, потому что они спрятаны под толстым слоем листьев.

Профилактика необходима для предотвращения появления яиц и скрученных листьев. В первую очередь требуется проводить весеннюю обрезку, при которой удаляются все повреждённые побеги с признаками присутствия насекомых.

После снятия зимнего укрытия нужно осмотреть кустарник, при наличии кладок яиц, их необходимо снять и сжечь;
Кустарник и участок под ним нужно обработать инсектицидом;
При распускания почек розу нужно подкормить азотным удобрением;
В апреле вылупляются гусеницы, при появлении их на кусте, насекомых нужно собрать вручную или обработать куст специальным средством;
В мае при пояа скрученных листьев, требуется их удалить вручную и сжечь;
Летом в период лета бабочек необходимо опрыскивать куст отпугивающими препаратами. Розанная листовертка – ночная бабочка, которая вступает в активность с наступлением сумерек. Обработку нужно проводить до наступления активности насекомых;
В осенний период перед укутыванием кустарника, необходимо убрать все сухие листья с земли и сжечь их.

Розанная листовертка может появиться на любой розе, не застрахован ни один сорт. Правильная профилактика, регулярный осмотр растения и своевременной уход помогут снизить риски появления насекомых до минимума. Вредитель способен погубить хрупкое растение за один сезон, поэтому необходимо соблюдать меры по защите и приступать к борьбе с насекомыми незамедлительно.

Заметили ошибку? Выделите ее и нажмите Ctrl+Enter, чтобы сообщить нам.

НАСЕКОМЫЕ-ВРЕДИТЕЛИ ЛЕСА УРАЛЬСКОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА

Листовертка лиственничная — Zeiraphera diniana (Gn.)

Рис. 1. Имаго лиственничной листовертки

Передние крылья бабочки довольно узкие, светло-серые, блестящие, с сеткой неясных коричневых штрихов, с темно-коричневыми пятнами и полосами, а также серой бахромой (рис. 1). Рисунок и окраска крыльев очень вариабельны: иногда преобладают светлые, почти белые оттенки, а иногда могут быть передние крылья как будто покрыты серой пылью. Задние крылья довольно широкие, немного заостренные, серо-коричневые, со светлой серой бахромой. В размахе крыльев бабочка имеет 18-20 мм. Молодые гусеницы имеют красноватую окраску, только взрослеющие гусеницы принимают типичную окраску — грязно-зеленую, а на спине и с обоих сторон имеют темно-зеленые полосы (рис. 2). Иногда могут быть и одноцветные гусеницы — темно-зеленые. Примерно за неделю перед окукливанием гусеницы темнеют и на зеленой окраске появляются серые, коричневые или черноватые оттенки. Голова и затылочный щиток черные или почти черные. Спинные реснитчатые щитки темные, округлые и сравнительно крупные. На верхней стороне брюшных сегментов хорошо заметны шипы. Гусеницы достигают длины 10-12 мм. Куколка коричневая или черно-коричневая, длиной около 8 мм. На спинной части брюшных сегментов поперечные ряды небольших, смотрящих назад шипов, с помощью которых куколка высовывается из кокона. Кокон изготовлен из волокон, довольно густой, на внешней стороне вплетена опавшая хвоя.

Бабочки появляются в насаждениях с июля до октября в зависимости от географического местоположения и погоды. Имаго днем спокойно сидят с крышевидно сложенными крыльями, а вечером летают возле крон деревьев. Оплодотворенная самка откладывает небольшие кучки желтоватых яичек (обычно 3-6, а иногда и больше штук) под чешуйки коры или в трещинки, чаще всего в мутовки веточек. Там яички в эмбриональной диапаузе перезимовывают и способны пережить очень низкие температуры (напр. -50 °С).

Рис. 2. Гусеница лиственничной листовертки (

Весной во время распускания хвои из яиц выходят мелкие темные гусеницы. Они соединяют паутинками хвою и питаются ею, позже образуют характерные воронкообразные коконы; начиная с 4-го возраста поедают отдельные хвоинки или живут отдельно в трубкообразных коконах (рис. 3).

Рис. 3. Важный признак поражения лиственницы лиственничной листоверткой — хвоя,

оплетенная паутиной (http://www.panoramio.com)

Гусеницы лиственничной листовертки повреждают хвою ели, сосны или лиственницы в зависимости от части ареала. Поселяются они в мутовках почек, соединяя их и поедая молодую хвою. На рисунке изображено повреждение гусеницами лиственничной листовертки молодых побегов ели. Гусеницы проникают в распускающиеся побеги и волокнами присоединяют почечные чешуйки к распускающейся хвое, которую постепенно поедают (рисунок слева). Позже, более взрослые гусеницы питаются побегами и полностью поедают хвою (рисунок справа). Поврежденные побеги напоминают повреждения гусениц елового пилильщика. Иногда гусеницами бывают повреждены и молодые еловые шишки.

Рис. 4. Лес, дефолиированный лиственничной листоверткой

(http://www.panoramio. com)

В течение развития гусеницы проходят 5 возрастов, каждый из первых четырех продолжается 4-5 дней, а последний — 7-10 дней, так, что питание гусениц длится в целом 3-4 недели. На продолжительность периода питания влияют неравномерность развития, климат, погода и поэтому в целом этот период в природе длится несколько дольше. В начале лета взрослые гусеницы по волокнам спускаются к земле и проникают в верхний слой лесной подстилки. Там из хвои делают кокон и окукливаются. Через 10-14 дней, редко дольше, куколка высовывается из кокона с помощью шипов на брюшке и вылетает бабочка. Взрослая особь живет всего около 3 недель.

Лиственничная листовертка принадлежит к скандинавско-сибирским видам. В Европе распространена лишь в альпийских областях на высоте 1600-2100 м н. у. м. В России распространена по всей зоне хвойных лесов европейской части, Сибири, Приморского края до крайнего севера. Вспышки массового размножения возникают преимущественно в лесах восточной Сибири. Так, в 70-х годах вспышка массового размножения этого филлофага отмечена в Южной Якутии (Аммосов, 1972).

Необходимо различать значение этого вредителя для лиственницы в альпийских областях Европы и других хвойных в остальных областях ареала. В Скандинавии лиственничная листовертка является важным вредителем сосны, а в средней и восточной Европе повреждает, в основном, еловые насаждения всех возрастов (рис. 4). Установлено отрицательное влияние лиственничной листовертки Zeiraphera diniana на образование шишек лиственницы. В Альпах у лиственничной листовертки (Zeiraphera griseana Hbn) цикл роста численности популяции (до 10 тысяч раз) наблюдается, примерно, раз в 10 лет (Baltensweiler, 1964)

Борьба с вредителями груши

С наступлением весеннего тепла в сад в поисках пищи приходят разные насекомые. К сожалению, многие из них находят себе жилье и корм на груше. Рассмотрим каждого насекомого-вредителя груши, чтобы знать «врага» в лицо. Действия вредителей сада крайне негативно сказываются на урожае и состоянии деревьев в саду.

Грушевая листоблошка

Это насекомое очень часто поражает груши садоводов еще до набухания почек. Его еще называют медяницей. После зимовки в земле насекомое выползает на дерево и питается соком почек, именно по этой причине грушевая листоблошка опасна для плодоношения деревьев. Всасывание сока листа приводит к его деформации, плоды же приобретают некрасивые формы и деревянистую консистенцию. Повреждение коры медяницей приводит к выделению сахароподобной липкой жидкости. Ее называют медвяной росой. Стекая на землю, она порождает огромное количество вредителей в почве.

Плодожорка грушевая

Эти вредители поражают только плоды дерева. Внешне насекомое похоже на серокрылую бабочку. Гусеницы, которые живут на деревьях, достигают длины в 20 мм, имеют коричневую окраску головы и белое тельце. Живут и размножаются грушевые плодожорки в земле под деревом или в опавшей листве. Гусеницы заползают внутрь плода и питаются его семечками. Через 30 дней гусеница уходит в почву на окукливание.

Как уберечь сад от размножения грушевой плодожорки?

Перекапывайте почву после лета;
Обрабатывайте деревья в начале сезона;
Вовремя убирайте опавшие и гнилые плоды.

Галлица плодовая

Существует лиственная и плодовая разновидность галлицы. Лиственная галлица поражает плоды, побеги и листья, которые сохнут и опадают. Взрослые особи галлицы плодовой похожи на комаров. Зимуют в почве, а ранней весной появляются и поражают грушу. Насекомые живут в плоде до его созревания. Зараженный плод созревает гораздо быстрее, чем здоровые фрукты. Завязь с вредителем груши засыхает, морщится и опадает. Галлица плодовая очень опасна скоростью, с которой она портит урожай. Так, за месяц своей жизни насекомое заражает практически 90% плодов.

Плодовый клещ

Плодовый клещ часто селится на груше и представляет большую опасность для нормального развития и плодоношения дерева. Клещ высасывает питательные вещества из клеток листа. Из-за этого слабый лист сохнет и опадает. Чтобы предотвратить заражение клещами, рекомендуется опрыскивание дерева во время формирования бутонов.

Листовертка

Это насекомое селится на многих разновидностях плодовых культур, потому что питается практически всеми частями растения. Появление листовертки на груше можно определить по свисающим на тонкой паутине гусеницам. Если листоверток мало, можно собрать их вручную. При больших количествах вредителей груши их следует уничтожать как можно скорее. Рекомендуется профилактическое опрыскивание деревьев в начале весны, а также после цветения.

Существует большое количество вредителей груши. Для профилактики заражения ими всего урожая регулярно и тщательно осматривайте деревья, проверяйте состояние коры, плодов, листьев и соцветий. Принимайте меры даже при самых незначительных изменениях, потому что популяции вредителей очень быстро растут. Вредители груши могут значительно навредить дереву, замедлить или полностью остановить его развитие или существенно снизить урожайность. Качественные и количественные показатели урожайности напрямую связаны с правильным и своевременным уходом за садом. Мы проводим поэтапные плановые опрыскивания для уничтожения насекомых как на дереве, так и в почве.

Новая мишень в борьбе с хлопковой листоверткой

Феромоны часто служат основой для методов биоконтроля, направленных на отлов насекомых-вредителей или нарушение их обонятельной коммуникации. Одним из таких вредителей является хлопковая листовертка ( Spodoptera littoralis ), инвазивный вид моли во Франции, который также встречается в Средиземноморском бассейне, Африке и на Ближнем Востоке. Его гусеницы чрезвычайно многоядны: они могут питаться всеми органами растений и поедать разнообразные виды сельскохозяйственных культур. Другие виды рода Spodoptera , такие как совка ( Spodoptera frugiperda ), также являются чрезвычайно многоядными вредителями и представляют угрозу для европейского сельского хозяйства. Идентификация рецепторов феромонов у этих видов может дать ученым надежные цели при разработке новых стратегий биоконтроля.

Синель Spodoptera littoralis

В недавно опубликованном исследовании исследователи систематически собирали функциональные данные обо всех обонятельных рецепторах хлопковой листовертки.Они обнаружили рецептор полового феромона, который принадлежал к новой категории рецепторов феромона. В тандеме они использовали инструменты CRISPR/Cas9 для создания мутантов, у которых рецептор был нокаутирован, чтобы проверить его важность в половом общении бабочки. Мутанты больше не могли обнаруживать половой феромон и не могли нормально спариваться. Рецептор и его лиганд были запатентованы для использования при нарушении спаривания в качестве мишени для «фероцидов».

Исследование также показало, что этот новый рецептор является единственным.Предыдущие исследования показали, что все рецепторы феромонов моли возникли в результате одного эволюционного события и произошли от линии традиционных обонятельных рецепторов. Однако это исследование показало, что рецептор хлопковой листовертки принадлежит к отдаленно связанной линии, что указывает на то, что рецепторы феромонов у мотыльков могли независимо развиваться по крайней мере два раза. Лучшее понимание эволюции этих рецепторов может помочь нам понять, как передача феромонов участвует в процессах видообразования.Это может одновременно прояснить, как насекомые становятся устойчивыми к пестицидам на основе феромонов: любые изменения, происходящие в рецепторе, могут изменить реакцию насекомых на данное соединение и могут сделать их неуязвимыми.

¹ Работа выполнена в рамках ОВР по защите растений (BiPi). BiPi — это партнерство французских и китайских исследователей, запущенное в марте 2019 года. Прямая ссылка

Артикул

Новая линия потенциальных феромонных рецепторов для полового общения у мотыльков
Bastin-Héline et al., (2019) eLife, https://doi.org/10.1101/707174

Биохимические механизмы устойчивости к метоксифенозиду хлопковой листовертки Spodoptera littoralis

Задний план: Метоксифенозид является инсектицидом, специфичным для чешуекрылых, который принадлежит к новой группе инсектицидов, нестероидных агонистов экдистероидов, также называемых соединениями, ускоряющими линьку (MAC).Чтобы исследовать риск резистентности и возможные механизмы, обеспечивающие резистентность к метоксифенозиду, авторы выбрали в лаборатории устойчивый штамм хлопковой листовертки Spodoptera littoralis (Boisd.), который является репрезентативной моделью чешуекрылых и важным вредителем хлопка и овощей во всем мире. , с высоким риском развития резистентности.

Результаты: После селекции метоксифенозидом в течение 13 поколений данные по токсичности показали, что у отобранного штамма развилась пятикратная устойчивость к метоксифенозиду по сравнению с чувствительным штаммом.Измерение ферментов детоксикации показало, что активность монооксигеназы (МО) у выделенного штамма была в 2,1 раза выше, тогда как для эстераз и глутатион-S-трансфераз изменений не было. Когда ингибиторы пиперонилбутоксид (PBO), S,S,S-трибутилфосфоротритиоат (DEF) и диэтилмалеат были протестированы в качестве синергистов, соответствующие синергетические отношения составили 0,97, 0,96 и 1,0 для чувствительного штамма и 2,2, 0,96 и 1,1 для восприимчивого штамма. резистентный штамм. Значительный синергетический эффект ФБО согласуется с повышенной активностью МО в выбранном штамме.

Вывод: В целом настоящее исследование подтверждает важность МО-опосредованного метаболизма при устойчивости к метоксифенозиду, определяя тактику борьбы с развитием устойчивости к этой новой группе инсектицидов.

Оценка двух экологически чистых растительных масел на хлопковом листовом черве Spodoptera littoralis (Boisd) (Lepidoptera/Noctuidae)

https://doi.org/10.1016/j.aoas.2018.09.002Получить права и содержание

Abstract

Хлопковая листовертка, Spodoptera littoralis , является основным вредителем ряда экономических культур. Производитель использовал интенсивные химические пестициды, чтобы уменьшить их популяцию, что привело к появлению новых поколений. Настоящий поиск направлен на то, чтобы предложить другие компоненты из природных источников, которые более безопасны для экосистемы и обладают способностью снижать запрет на насекомых. Были проведены эксперименты по изучению влияния двух растительных масел (Moringa Moringa oleifera L.и горького миндаля, Prunus amygdalus var amara), которые были приготовлены по специальной рецептуре на выводимость яиц и процент смертности личинок 1-го, 3-го возрастов и их влияние на процесс питания и приспособленность хлопкового листового червя, Spodoptera littoralis (Boisd. ) в лабораторных условиях. Различные концентрации тестируемых масел фиксировали воздействие на всех стадиях, но на различных уровнях. Наибольшее снижение выводимости яиц и процент смертности личинок 1-го и 3-го возрастов зафиксировано при обработке 10% концентрацией горького миндаля.Индексы роста и приспособленности личинок и окукливание 10% горького миндаля. Кормление личинок 3-го возраста листьями, обработанными 5% горького миндаля, также вызывало снижение скорости потребления корма (55,5%), а зарегистрированный антифидантный индекс достигал 38,2% по сравнению с контролем. Настоящие результаты ясно показывают, что испытанные растительные масла проявляют инсектицидную и противокормовую активность в отношении яиц и личиночных стадий хлопковой листовертки.

Ключевые слова

Натуральные масла

Хлопковая листовертка

Потребление продуктов питания

Антифидант

Фитнес-индекс

Рекомендуемые статьиСсылки на статьи (0)

2018 Производство и хостинг. V. от имени сельскохозяйственного факультета Университета Айн-Шамс.

Ссылки на статьи

%PDF-1.4 % 159 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 159 76 0000000016 00000 н 0000002439 00000 н 0000002586 00000 н 0000003221 00000 н 0000003597 00000 н 0000003974 00000 н 0000004088 00000 н 0000004125 00000 н 0000004237 00000 н 0000005166 00000 н 0000005910 00000 н 0000006666 00000 н 0000007147 00000 н 0000007899 00000 н 0000008148 00000 н 0000008776 00000 н 0000009037 00000 н 0000009505 00000 н 0000010480 00000 н 0000010858 00000 н 0000011250 00000 н 0000011382 00000 н 0000011637 00000 н 0000012030 00000 н 0000012392 00000 н 0000012419 00000 н 0000012994 00000 н 0000013250 00000 н 0000014316 00000 н 0000015349 00000 н 0000015802 00000 н 0000015937 00000 н 0000016204 00000 н 0000016720 00000 н 0000016747 00000 н 0000017047 00000 н 0000018122 00000 н 0000019128 00000 н 0000019380 00000 н 0000019450 00000 н 0000019616 00000 н 0000046387 00000 н 0000056184 00000 н 0000094401 00000 н 0000094649 00000 н 0000094719 00000 н 0000095173 00000 н 0000116085 00000 н 0000157232 00000 н 0000162279 00000 н 0000179753 00000 н 0000182211 00000 н 0000201067 00000 н 0000203689 00000 н 0000215195 00000 н 0000217297 00000 н 0000217677 00000 н 0000231057 00000 н 0000234199 00000 н 0000246386 00000 н 0000248591 00000 н 0000256981 00000 н 00002

00000 н 0000292795 00000 н 0000296080 00000 н 0000298495 00000 н 0000488293 00000 н 00004

00000 н 0000640599 00000 н 0000649931 00000 н 0000650183 00000 н 0000650542 00000 н 0000660868 00000 н 0000661129 00000 н 0000002261 00000 н 0000001853 00000 н трейлер ]>> startxref 0 %%EOF 234 0 объект >поток xb«d`hb`c8 Ȁ

Границы | Распределение гликановых мотивов на поверхности клеток средней кишки хлопковой листовертки (Spodoptera littoralis), продемонстрированное связыванием лектина

Введение

Растущее количество данных подчеркивает биологическую важность гликанов на разных уровнях физиологии живых организмов. Гликаны, обнаруженные в клетках, в основном связаны с белками через аспарагин, серин/треонин или триптофан в составе N -, O — или C -гликопротеинов. Кроме того, белки также могут быть связаны через серин или треонин с выработанными цепями гликозаминогликанов (GAG). Все эти гликаны построены из общего набора моносахаридов, включая, помимо прочего, маннозу (Man), глюкозу (Glc), фукозу (Fuc), галактозу (Gal), ксилозу (Xyl), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), N-ацетилгалактозамин (GalNAc) и сиаловая кислота (Varki et al., 2009).

Как и в других организмах, гликаны насекомых участвуют во множестве биологических явлений (обзор в Walski et al., 2017). Например, гликолипиды принимают участие в сигнальном пути эпидермального фактора роста, созревании ооцитов и формировании нервно-мышечных соединений (Chen et al., 2007; Pizette et al., 2009). N -гликозилирование важно для иммунных реакций насекомых (Herrero et al., 2007; Mortimer et al., 2012), функционирования нервной системы, движения и определяет продолжительность жизни (Sarkar et al. , 2006; Репникова и др., 2010; Като и Тимейер, 2013). Примеры функций O -связанного гликана включают опосредование клеточной адгезии и образования трубки трахеи (Tian and Ten Hagen, 2007a,b; Zhang and Ten Hagen, 2011; Tran et al., 2012). Кроме того, N -связанное гликозилирование необходимо для фолдинга, стабильности, локализации и функции белка. Например, известно, что рецепторы, связанные с G-белком, такие как рецепторы родопсина и допамина, являются N -гликозилированными (Schwarz and Aebi, 2011; Verlinden et al., 2014), а наличие соответствующей гликановой цепи на родопсине Drosophila melanogaster имеет решающее значение для правильной локализации и фоточувствительности этих белков (Kunduri et al., 2014).

Кроме того, гликаны играют несколько ролей в пищеварительной системе насекомых. Например, O -GalNAc необходим для развития кишечника и его правильного закисления (Tran and Ten Hagen, 2013) и поддержания структуры перитрофического матрикса (Hegedus et al. , 2009; Toprak et al., 2010а,б). Более того, остатки GalNAc, украшающие аминопептидазы и щелочные фосфатазы, участвуют в связывании токсина Cry1Ac (Angelucci et al., 2008; Rodrigo-Simón et al., 2008; Ning et al., 2010). Фактически, большинство гликановых эпитопов, присутствующих на поверхности кишечного эпителия, являются возможными мишенями для связывания энтомотоксических лектинов, и показано, что это белково-углеводное взаимодействие необходимо для опосредования их цитотоксических эффектов (Fitches et al., 2001, 2008; Cristofoletti). et al., 2006; Hamshou et al., 2012; Вальски и др., 2014).

В отличие от множества примеров значимости гликанов для физиологии насекомых, имеется относительно мало данных о составе гликанов. Несколько доступных анализов были сосредоточены либо на целых организмах (Aoki et al., 2007), либо на отдельных белках (Kim et al., 2003; Knight et al., 2004) и редко на конкретных тканях или структурах, таких как пищеварительный тракт (Vancova и др., 2012). Ясно, что дополнительные исследования гликомии принесут пользу базовым знаниям о физиологии насекомых и дифференцировке клеток.

Состав гликанов чаще всего анализируют с использованием различных методов масс-спектрометрии и хроматографии. Эти методы обладают высокой чувствительностью и надежностью, но каждый тип гликанов ( N — или O -связанных, ГАГ, гликолипидов) требует специальных протоколов и отдельного анализа (Gutternigg et al., 2007; Johswich et al., 2009; Мехреф и др., 2009). Лектиновые микрочипы могут решить эту проблему и подходят для одновременного анализа всех типов гликанов, в том числе на целых клетках (Krishnamoorthy and Mahal, 2009; Rakus and Mahal, 2011).Однако ни один из этих методов не позволяет анализировать пространственную неоднородность распределения гликанов на поверхности тканей или клеток. Чувствительный пространственный анализ различных гликанов возможен с помощью MALDI-визуализации, однако эта технология по-прежнему ограничена разрешением изображения, которое недостаточно велико для анализа топологии гликанов на уровне отдельных клеток (Chaurand et al., 2007; Römpp and Spengler, 2013; Anderson). и др., 2014). Следовательно, для решения проблемы одновременного анализа различных типов гликанов и их пространственного распределения микроскопические методы по-прежнему остаются предпочтительным подходом.Использование мечения метаболических гликанов (Ning et al., 2008), антител (Laughlin and Bertozzi, 2009) или лектинов (Tian and Ten Hagen, 2007a; Mun et al., 2012) позволяет анализировать наличие специфических моносахаридов или гликанов. мотивы через N -, O -гликанов, гликолипидов или ГАГ одновременно и точно локализовать их, используя преимущества высокого разрешения электронной или световой микроскопии.

Вопрос о локализации различных гликановых эпитопов на клеточной поверхности особенно интересен для кишечника насекомых. In vivo средняя кишка личинок чешуекрылых состоит из псевдомногослойного эпителия столбчатых и бокаловидных клеток со стволовыми клетками, расположенными среди их базолатеральных поверхностей и опирающимися на базальную мембрану. Столбчатые клетки средней кишки, также называемые энтероцитами, представляют собой наиболее распространенный тип клеток и обычно поляризованы на апикальный и базолатеральный полюса. На апикальном полюсе эти клетки образуют микроворсинки, отвечающие за секрецию ферментов и поглощение питательных веществ (Lehane and Billingsley, 1996; Hakim et al., 2010). В прошлом первичные культуры различных насекомых готовили для изучения развития насекомых, репликации вирусов, развития и восстановления средней кишки (Hakim et al., 2001; Loeb et al., 2003). Кроме того, воздействие факторов роста (Hakim et al., 2009; Loeb, 2010), гормонов, таких как экдизон и ювенильный гормон (Smaghe et al., 2006), и инсектицидных токсинов, таких как Bacillus thuringiensis (Ning et al., 2010) были исследованы в этих культурах. Однако, насколько нам известно, эти отдельные клетки, свободно находящиеся во взвешенном состоянии в жидкой среде, не изучались на наличие гликановых мотивов на их поверхности.

В данной работе мы исследовали распределение гликановых мотивов на поверхности двух типов клеток эпителия средней кишки хлопковой листовертки Spodoptera littoralis , печально известного вредителя сельскохозяйственных культур, повреждающего более 40 видов растений во всем мире. После вскрытия средней кишки личинки были созданы первичные клеточные культуры для дифференцированных столбчатых клеток, которые преимущественно присутствуют в средней кишке насекомого, имеют микроворсинчатую щеточную кайму на апикальной стороне и участвуют в переваривании и всасывании пищи, а также для недифференцированных клеток. стволовые клетки, которые важны для развития и восстановления средней кишки.Впоследствии мы исследовали эти отдельные клетки с помощью массива из семи флуоресцентно меченных лектинов, которые охватывают ряд различных специфичностей связывания углеводов: олигомеры маннозы (GNA и HHA), GalNAc/Gal (RSA и SSA), GlcNAc (WGA и Nictaba) и Neu5Ac. (α-2,6)Gal/GalNAc (SNA-I). С помощью конфокальной микроскопии измеряли связывание лектина с различными областями клеточной поверхности (например, апикальной, базальной, латеральной) этих отдельных клеток в культуральной среде. Эти первичные культуры отдельных клеток позволили впервые исследовать две гипотезы, касающиеся важности гликановых мотивов для средней кишки насекомого. Во-первых, мы предполагаем, что апикальная/базолатеральная поляризация дифференцированных столбчатых клеток отражается различным распределением мотивов гликанов, и если это так, то это может определять функциональность клеток средней кишки. Во-вторых, паттерн гликозилирования стволовых клеток может изменяться в процессе дифференцировки, что отражается в изменении связывания лектина. Разница в связывании лектина между дифференцированными столбчатыми клетками и недифференцированными стволовыми клетками указывает на то, что дифференцировка клеток во время развития средней кишки связана с поляризацией и что эта поляризация связана с различиями в распределении гликанов.

Материалы и методы

Насекомые

Сплошная колония хлопковой листовертки S. littoralis содержалась на искусственной диете на основе агара в стандартных условиях 23–25°C, относительной влажности 60–70% и фотопериоде 16:8 (свет:темнота) ( Ига и Смагге, 2011).

Очистка лектинов и мечение с помощью FITC

GNA ( Galanthus nivalis Agglutinin) был выделен и очищен от G. Nivalis луковиц, HHA ( Hippeastrum гибридных агглютинина) от гиппеаструм гибридных луковиц, WGA (зародышевая пшеница аглутинина) от Trinticum Aestivum микробов, Nictaba из обработанных жасмонатом листьев Nicotiana tabacum , РСА ( Rhizoctonia solani агглютинин) из склеротов гриба R.solani , SSA ( Sclerotinia sclerotiorum агглютинин) из склеротов гриба S. sclerotiorum и SNA-I из лиофилизированной коры Sambucus nigra с использованием установленных протоколов, как описано ранее Van Damme et al. (1988, 1996, 1998); Ванденборре и др. (2009) и Hamshou et al. (2010а, 2012). Чистоту всех лектинов подтверждали с помощью SDS-PAGE.

Лектины были помечены изотиоцианатом флуоресцеина (FITC), как описано ранее (Hamshou et al., 2010b). Вкратце, лектины растворяли в 50 мМ буфере бората натрия (pH 8,5) и смешивали с 24-кратным молярным избытком FITC, растворенного в диметилформамиде. После инкубации при комнатной температуре в темноте в течение 2 ч свободную метку удаляли гель-фильтрацией на колонке Sephadex G25, уравновешенной PBS. Активность лектина в элюированных фракциях проверяли с помощью реакции агглютинации (Van Damme et al., 1988), а концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). Поскольку отношение молей FITC к молям лектина в конъюгате будет варьироваться между разными лектинами, прямое сравнение между разными лектинами невозможно.

Первичные клеточные культуры средней кишки

S. littoralis Личинки

Первичные культуры клеток средней кишки получали из активно питающихся последних возрастов S. littoralis . Рассеченные средние кишки получали, как описано у Cermenati et al. (2007) и клетки диссоциировали в течение 1,5 ч с помощью 2 мг/мл коллагеназы (тип I-AS; Sigma, Борнем, Бельгия) в физиологическом растворе насекомых (IPS) (Cermenati et al., 2007). IPS имитирует осмолярность, рН и солевой состав гемолимфы личинок чешуекрылых.Обработка коллагеназой дала культуру, состоящую из большого количества столбчатых клеток (более распространенный тип клеток в культуре, как in vivo ) и меньшего количества бокаловидных клеток и стволовых клеток.

Оценка взаимодействия лектина с столбчатыми и стволовыми клетками средней кишки личинок

Столбчатые и стволовые клетки средней кишки инкубировали в течение 1 часа с 0,85 мкМ FITC-меченых лектинов. При такой концентрации лектинов и при использовании аналогичных условий культивирования клеток лектины не влияют на жизнеспособность клеток во время эксперимента, как показано ранее (Shahidi-Noghabi et al., 2008; Ванденборре и др., 2008 г.; Hamshou et al., 2010a,b; Качча и др., 2012). Контрольные клетки инкубировали с равными количествами PBS. После инкубации клетки фиксировали в течение 15 мин 4% раствором параформальдегида в PBS. После трехкратного промывания PBS образцы помещали в среду Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Образцы исследовали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (Nikon A1R; Nikon Instruments, Париж, Франция) с использованием масляного объектива Plan Apo 60x/1,4.Лазер с длиной волны 488 нм использовали для возбуждения меченных FITC лектинов и для просвечивания, а флуоресценцию FITC регистрировали через полосовой фильтр 525/50 нм. Изображения были получены с размером пикселя 83 × 83 нм и толщиной оптического сечения 1 мкм. С помощью программного обеспечения ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) измеряли средние интенсивности пикселей в выбранной вручную микроворсинчатой зоне, базальной и латеральной части мембраны столбчатых клеток, а также в клеточной мембране (периметр ) стволовых клеток.Интенсивность флуоресценции как меру относительного количества связанного лектина рассчитывали отдельно для каждой отображаемой клетки как отношение средней интенсивности пикселей в данной зоне к фону. После ручного выбора контура клеточной мембраны интенсивность флуоресценции затем нормализовали путем расчета средней интенсивности пикселей в пределах зоны. Эта нормализация компенсирует различия в поверхности мембран между микроворсинчатой, базальной и латеральной зонами и позволяет полуколичественно оценить количество лектина, связывающегося с зонами клеточной мембраны.Связывание каждого отдельного лектина между зонами и типами клеток анализировали и сравнивали с использованием t -тестов в SPSS 22 Statistics 22 (IBM), p -значения ниже 0,05 были выбраны для обозначения статистически значимых различий.

Проверка специфичности связывания углеводов лектинами

FITC-меченых лектина (HHA, RSA и SNA-I) предварительно инкубировали в течение 30 мин со специфическими конкурирующими углеводами: 2 мг/мл маннанов дрожжей (Sigma) для HHA, 20 мМ GalNAc (Sigma) для RSA, 20 мМ α2,6-сиалиллактозамина (Carbosynth) для SNA-I или буфер для положительного контроля.Кроме того, FITC-меченый RSA предварительно инкубировали в течение 30 мин со 100 мМ специфического углевода GalNAc или неспецифического углевода, такого как GlcNAc (Sigma). Впоследствии мы подготовили первичные культуры клеток средней кишки из личинок последнего возраста S. littoralis , как указано выше, и инкубировали их со смесями в течение 1 часа. После промывания LPS клетки помещали на предметные стекла и визуализировали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом, как указано выше.

Для каждой клетки делали 5–8 z-срезов с интервалом 2 мкм.На каждом изображении вручную выбирался микроворсинчатый полюс клеток, а средняя интенсивность пикселей измерялась с помощью ImageJ. Соотношение интенсивности флуоресценции микроворсинчатого полюса и фона рассчитывалось для уменьшения влияния возможных несоответствий между картинками. Влияние инкубации со специфическим конкурирующим углеводом на связывание лектина анализировали с использованием независимого теста t в SPSS Statistics 22 (IBM).

Результаты

Связывание лектина с столбчатыми клетками

Для анализа распределения различных гликанов столбчатые клетки средней кишки инкубировали в течение 1 часа с мечеными FITC лектинами, специфически распознающими олигомеры маннозы (GNA и HHA), GalNAc/Gal (RSA и SSA), GlcNAc (WGA и Nictaba) и Neu5Ac. (α-2,6)Gal/GalNAc (SNA-I).Специфичность выбранных лектинов в отношении связывания углеводов охватывает большинство гликановых мотивов, которые могут присутствовать в клетках насекомых. Каждый испытанный флуоресцентно меченый лектин связывался с пограничной зоной микроворсинок на апикальной стороне столбчатых клеток (рис. 1). Измеренная интенсивность флуоресценции в микроворсинчатой области клетки была значительно выше, чем уровни аутофлуоресценции ( p < 0,05). Чтобы выявить пространственные различия в типе гликанов, присутствующих на столбчатых клетках кишечника, также было количественно определено связывание лектина с базальным полюсом и латеральными мембранами (таблица 1).Затем для каждой отдельной клетки рассчитывали относительное связывание лектина с тремя зонами клеточной мембраны. Таким образом, связывание в разных зонах было нормализовано, чтобы компенсировать различия в структуре мембран. Это позволило сгруппировать их в два кластера лектинов (рис. 1А). Четыре лектина относительно больше связывались с микроворсинками апикальной щеточной каймы, чем с базальным полюсом: WGA в 1,8 раза ( p = 0,001), SNA-I и RSA в 2,1 раза, SSA в 4,1 раза (все три p ). < 0.001). В свою очередь, GNA, HHA и Nictaba связывались преимущественно с базальным полюсом по сравнению с апикальными микроворсинками в 6,7 раза ( p <0,001), в 2,5 раза ( p <0,001) и в 2,0 раза ( p = 0,049). , соответственно. Кроме того, (рис. 1B), SNA-I, RSA, SSA и WGA показали связывание с микроворсинками в 2,1, 2,6, 3,0 и 4,6 раза выше (все четыре p <0,001) по сравнению с латеральными мембранами соответственно. Только в случае ЗНА интенсивность флуоресценции была значительно выше (2.в 8 раз, p <0,001) в латеральной зоне по сравнению с апикальной каймой щетки. Кроме того, как показано на рисунке 1C, мы наблюдали более высокое связывание с базальным полюсом по сравнению с латеральными мембранами для GNA, HHA ( p <0,001), WGA ( p = 0,018) и RSA ( p = 0,027).

Рисунок 1 . Лектин связывается с различными областями на поверхности столбчатых клеток средней кишки Spodoptera littoralis . (A,B) Соотношение связывания FITC-меченого лектина с базальной (A) или латеральной (B) зонами по сравнению с интенсивностью связывания с микроворсинками предполагает, что гликаны распознаются SSA, RSA, WGA и SNA-I более многочисленны в зоне микроворсинок, в то время как те, которые распознаются Nictaba, HHA и GNA, более многочисленны на базальных полюсах.Данные представлены как средние значения ± SEM. Звездочки указывают на статистически значимые различия ( p < 0,05, независимая выборка t -тест). (C) Сравнение между базальной и латеральной частями клеточных мембран указывает на дифференциальное связывание для WGA, RSA, HHA и GNA. Данные представлены как средние значения ± SEM. Звездочки указывают на статистически значимые различия ( p < 0,05, независимая выборка t — тест). (D–J) Репрезентативные конфокальные изображения столбчатых клеток средней кишки, инкубированных с FITC-мечеными лектинами: GNA (D) , HHA (E) , Nictaba (F) , SNA-I (G) , WGA (H) , RSA (I) и SSA (J) .Изображения клеток ориентированы так, чтобы показать микроворсинчатую зону вверху. Шкала бара составляет 20 мкм.

Таблица 1 . Интенсивность связывания лектина с различными областями на поверхности столбчатых клеток и стволовых клеток из средней кишки личинок Spodoptera littoralis .

Как показано на рис. 2, в табл. 2, предварительная инкубация HHA, RSA и SNA-I с их конкурирующими углеводами (маннанами дрожжей, GalNAc и 2,6-сиалиллактозамином) приводила к значительному снижению связывания с микровиллярный столб.Кроме того, предварительная инкубация с высокой концентрацией неспецифического углевода (100 мМ GlcNAc) не показала снижения связывания RSA с микроворсинками, в то время как взаимодействие с лектином значительно уменьшилось после предварительной инкубации с использованием той же концентрации углевода. конкурирующий углевод (GalNAc) (табл. 2). Эти результаты показали, что связывание лектина с микроворсинками зависит от гликана или, по крайней мере, частично зависит от гликана.

Рисунок 2 . Специфичность связывания лектина.Изображения конфокальной микроскопии меченого FITC лектина, связывающегося с поверхностью столбчатых клеток средней кишки Spodoptera littoralis после предварительной инкубации с конкурирующими углеводами. (A–D) Связывание SNA-I без (A,B) или после предварительной инкубации (C,D) с SiaLacNAc. (E–H) Связывание RSA без (E,F) или после предварительной инкубации (G,H) с GalNAc. (I–L) Связывание HHA без (I,J) или после предварительной инкубации (K,L) с маннанами дрожжей.В каждом случае конкурирующие углеводы уменьшали связывание лектина, указывая на то, что связывание лектина опосредовано гликанами, присутствующими на поверхности клеток средней кишки. Шкала бара составляет 20 мкм. Стрелками указаны апикальные микроворсинки.

Таблица 2 . Ингибирующее действие углеводов на связывание различных лектинов с апикальной мембраной столбчатых клеток средней кишки личинок Spodoptera littoralis .

Связывание лектина со стволовыми клетками

На следующем этапе связывание флуоресцентно меченных лектинов с различными зонами клеточной поверхности сравнивали между столбчатыми клетками и стволовыми клетками, чтобы выявить потенциальные изменения в составе гликанов, связанные с процессом дифференцировки (рис. 3).Этот подход показал, что SSA, SNA-I и WGA и в меньшей степени HHA связываются с периметром стволовых клеток с относительно меньшей интенсивностью по сравнению с апикальной микроворсинчатой зоной столбчатых клеток на 5,1, 3,8, 3,3 ( все три p < 0,001) и 1,4 ( p = 0,034) раза соответственно. Напротив, Nictaba и GNA сильнее связывались с периметром стволовых клеток, чем с микроворсинками щеточной каймы столбчатых клеток, на 5,3 ( p = 0,001) и 2.в 6 раз ( p < 0,001), а для RSA разницы не было ( p = 0,448).

Рисунок 3 . Связывание лектина с поверхностью стволовых клеток средней кишки Spodoptera littoralis . (A) Отношение интенсивности флуоресценции клеточных мембран стволовых клеток к интенсивности связывания с микроворсинками столбчатых клеток указывает на дифференциальное связывание лектина с двумя типами клеток. Данные представлены как средние значения ± SEM. Звездочками отмечены статистически значимые различия ( p < 0. 05, независимая выборка т -тест). (B–H) Репрезентативные конфокальные изображения стволовых клеток, инкубированных с FITC-мечеными лектинами: GNA (B) , Nictaba (C) , RSA (D) , HHA (E) , SNA- I (F) , WGA (G) и SSA (H) . Шкала бара составляет 10 мкм.

Кроме того, мы наблюдали, что HHA и SNA-I связывались с более высокой интенсивностью как с базальной, так и с латеральной поверхностью столбчатых клеток, в то время как результат был противоположным для RSA и Nictaba.По сравнению с периметром стволовых клеток нормализованное связывание GNA и WGA было выше в зонах латеральной мембраны, но существенно не отличалось в базальных зонах (табл. 1).

Обсуждение

Специфичность, благодаря которой лектины распознают и связывают определенные фрагменты гликанов, делает их мощными инструментами для изучения распределения гликанов в тканях и клетках. В данной работе мы использовали массив из семи лектинов для изучения пространственного распределения углеводных структур в разных зонах клеточной мембраны столбчатых клеток средней кишки: маннозных олигомеров (GNA и HHA), GalNAc/Gal (RSA и SSA), GlcNAc (WGA). и Nictaba) и Neu5Ac(α-2,6)Gal/GalNAc (SNA-I).Кроме того, были проанализированы различия в структуре гликанов между дифференцированными столбчатыми клетками и недифференцированными стволовыми клетками.

Присутствие маннозы, GlcNAc и GalNAc в гликанах насекомых хорошо известно. Остатки маннозы обнаружены в большинстве N -гликанов насекомых (Aoki et al., 2007; Rendić et al., 2008; Dojima et al., 2009; Walski et al., 2016, 2017), в гликофосфатидилинозитоловых якорях. (Varki et al., 2009) и в незначительной фракции O -гликанов (Aoki et al., 2008). Олигомеры GlcNAc присутствуют в хитине или в хитобиозном ядре всех N -гликанов, в то время как концевые GlcNAc можно найти в гликосфинголипидах, небольшой фракции сложных и гибридных N -гликанов, а также в O -гликанах. (Аоки и др., 2007, 2008; Варки и др., 2009). Остатки GalNAc обнаружены в D. melanogaster O -гликанах и большинстве гликосфинголипидов (Varki et al., 2009) и в очень редком комплексе N -гликанов (Aoki and Tiemeyer, 2010; Kurz et al., 2015). В соответствии с предыдущими выводами мы наблюдали связывание лектинов с этими углеводными остатками в клетках средней кишки S. littoralis (Lepidoptera). Ранее связывание некоторых из этих лектинов с эпителием средней кишки было показано in vivo или на выделенной цельной средней кишке (Fitches et al., 2001; Hamshou et al., 2010a, 2013; Caccia et al., 2012). Однако из-за организации и архитектуры клеток в интактной ткани средней кишки с перитрофическим матриксом в просвете, пластинкой и мышечным слоем на базальной стороне и клетками, расположенными в многослойном эпителии (Hakim et al., 2010), только апикальная зона клетки доступна для связывания с лектинами. Использование первичных клеточных культур, содержащих отдельные клетки средней кишки в виде свободных клеток, взвешенных в жидкой среде, позволяет изучать распределение гликановых структур по всей клеточной мембране с беспрепятственным доступом ко всем внешним сторонам клетки.

Наши наблюдения показали четкое распределение связывания лектина с поверхностью эпителиальных клеток S. littoralis средней кишки, и это, по-видимому, связано с углеводной специфичностью лектинов.Различия в поверхности мембран между апикальной щеточной каймой, латеральной и базальной зонами не позволяли напрямую сравнивать измеренные интенсивности. Чтобы компенсировать различия в складках мембран, интенсивность нормализовали. Эта нормализация является оценочной и не совсем точной, но она дает четкое представление о различиях в связывании лектина с тремя зонами.

Предварительная инкубация лектинов SNA-I, HHA и RSA с соответствующими комплементарными гликоконъюгатами 2,6-сиалиллактозамином, маннанами дрожжей (полисахаридами маннозы) и N -ацетилгалактозамином привела к значительному снижению связывания лектина с микроворсинками. .Этот результат продемонстрировал, что связывание лектинов с эпителиальными клетками средней кишки насекомых, по крайней мере, частично опосредовано связыванием с гликановыми остатками, присутствующими на клеточной поверхности. Это соответствует предыдущим экспериментам Caccia et al. (2012) и Hamshou et al. (2013), где было показано, что связывание HHA с клетками средней кишки S. littoralis и связывание RSA с клетками средней кишки CF-203 значительно снижалось после предварительной инкубации лектинов с их комплементарными гликоконъюгатами.Точно так же предварительная инкубация SSA с GalNAc или асиаломуцинами значительно снижала клеточную токсичность лектина по отношению к клеткам CF-203 (Hamshou et al., 2010a). А исследования с мутированным SNA-I показали, что сайты связывания углеводов необходимы для инсектицидной активности лектина (Shahidi-Noghabi et al., 2008).

Паттерны связывания лектина в этом исследовании предполагают, что GalNAc и терминальные остатки GalNAc (наиболее вероятно на O -гликанах и/или гликосфинголипидах) более распространены в апикальной области столбчатых клеток средней кишки, тогда как остатки маннозы (наиболее вероятно на высоких — и олигоманнозные N -гликаны), по-видимому, более распространены в базальной области этих клеток. Сходным образом исследования связывания лектина у D. melanogaster показали, что фрагменты GalNAc более распространены в апикальных/люминальных областях клеток кишечника и трахеи (Theopold et al., 1996; Tian and Ten Hagen, 2007b). Это распределение по эпителиальным столбчатым клеткам средней кишки, отражающееся в различиях гликановых мотивов между базальной и латеральной мембранами, может быть связано с присутствием разных мембранных белков и разной степенью функций этих мембранных зон.В то время как базальная и латеральная мембраны участвуют во взаимодействиях клетка-клетка и клетка-матрикс, являясь процессами, в которых гликаны играют специфическую роль (Varki and Lowe, 2009), апикальная мембрана является первичным местом для многих физиологических, биохимических и биологических взаимодействий. Присутствие клатрина и высвобождение пищеварительных ферментов на верхушечной кайме щетки необходимы для переваривания и усвоения питательных веществ. Кроме того, на апикальной мембране происходит взаимодействие с токсинами и энтомотоксичными лектинами. Было показано, что токсин Cry1 из B. thuringiensis ( Bt ) связывает два модифицированных GalNAc мембранных белка, присутствующих в апикальной щеточной кайме, и связывание токсина Bt зависело от их N -гликозилирования (Jurat-Fuentes). и Аданг, 2004 г.; Перера и др., 2009 г.). Точно так же эксперименты с сильно инсектицидным лектином RSA выявили четыре предположительно гликозилированных белка, модифицированных GalNAc-фрагментами, связанных с апоптозом, в качестве потенциальных мишеней (Hamshou et al., 2013). Напротив, лектин GNA, связывающий маннозу, преодолевает эпителиальный барьер и проникает в гемолимфу насекомых, где он может связываться со своими мишенями и вызывать системные токсические эффекты (Powell et al., 1998; Caccia et al., 2012).

Гликозилирование является одним из важных факторов, регулирующих нацеливание белков в клетки. Некоторые примеры показали, что и N -, и O -гликаны необходимы как для апикальной, так и для базальной сортировки, но влияние гликозилирования, по-видимому, зависит от белка (Alfalah et al. , 1999; Хуэт и др., 2003 г.; Поттер и др., 2006). Например, N -гликозилирование необходимо для апикальной сортировки химеры Mouse Fc/LDL-рецептор в клетках MDCK (Gut et al., 1998). Однако для нейротрофина O -гликаны управляют его апикальной сортировкой, и их удаление приводит к исключительно базолатеральному нацеливанию (Yeaman et al., 1997). Более того, экспрессия в кишечнике pgant5 , кодирующего полипептид GalNAc-transferase 5, необходима для жизнеспособности плодовых мушек (Tran et al., 2012).Сайед и др. (2012) сообщили, что отложение в просвете предположительно O -гликозилированных белков необходимо для правильного развития и роста D. melanogaster задней кишки. Специфическое распределение в профилях гликанов также наблюдается для эпителиальных клеток позвоночных, у которых апикальные мембраны обогащены гликосфинголипидами (Füllekrug, Simons, 2004; Schuck, Simons, 2004).

Особым наблюдением в этом исследовании было специфическое связывание SNA-I на полюсе щеточной каймы столбчатых клеток средней кишки, что предполагает наличие сиалированных гликанов. Однако наличие сиалилированных гликанов у насекомых многие годы вызывает споры, и только в нескольких анализах, где была достигнута достаточно высокая чувствительность, можно было однозначно обнаружить присутствие сиалированных N -гликанов (Roth et al., 1992; Аоки и др., 2008; Аоки и Тимейер, 2010). Функциональные α-2,6-сиалилтрансферазы и Sia-синтазы присутствуют у насекомых (Репникова и др., 2010; Ислам и др., 2013; Kajiura et al., 2015), а сиалилированные гликаны были обнаружены, но в небольшом количестве, что наиболее вероятно, из-за отсутствия ферментов, необходимых для синтеза ManNAc (UDP- N -ацетилглюкозамин-2-эпимераза), ключевого интермедиата для синтеза Neu5Ac (Angata and Varki, 2002; Koles et al., 2009). Поскольку геномы насекомых, доступные на сегодняшний день, содержат все другие ферменты, необходимые для процесса сиалирования ( N -ацетилманнозаминкиназа, N -синтаза фосфата ацетилнейраминовой кислоты, CMP- N -синтаза ацетилнейраминовой кислоты и α2,6-сиалилтрансфераза). ), можно с некоторой уверенностью ожидать, что присутствие ManNAc или сиаловой кислоты среди питательных веществ сделает возможным сиалирование гликанов (Angata and Varki, 2002). Это явление сиалирования из-за присутствия сиаловой кислоты в среде ранее наблюдалось в культивируемых клеточных линиях насекомых (Hollister et al., 2003). Точно так же возможно, что специфическое связывание SNA-I может быть усилено сиалилированными белками, присутствующими в пище гусениц. Действительно, используемая искусственная диета содержит κ-казеин коровьего молока, который представляет собой сиалированный белок (Holland et al., 2005). При приеме пищи этот казеиновый белок присутствует в средней кишке и может усиливать сиалирование белков в столбчатых эпителиальных клетках средней кишки S. littoralis .

С недифференцированными стволовыми клетками мы наблюдали интригующую разницу в мотивах связывания лектина с поверхностью по сравнению с дифференцированными столбчатыми клетками средней кишки. Видно, что SSA, HHA, WGA и SNA-I относительно меньше связываются с периметром недифференцированных круглых стволовых клеток по сравнению с щеточной каймой дифференцированных столбчатых клеток, в то время как для Nictaba и GNA наблюдалась обратная ситуация. Различий в окрашивании лектинов в случае RSA не наблюдалось. Из-за поразительных различий в характере связывания между лектинами, обладающими сходной специфичностью связывания углеводов, такими как RSA и SSA или GNA и HHA, до сих пор нельзя сделать абсолютных выводов относительно различий в профилях гликозилирования между стволовыми и столбчатыми клетками. , и дальнейшие исследования по этой теме интригуют.Однако следует отметить, что родственные лектины могут демонстрировать тонкие различия в своей специфичности в отношении гликанов: например, GNA и HHA сильно реагируют с маннанами дрожжей, но HHA сильно связывается с галактоманнанами и линейным α1,3-связанным маннаном, в то время как связывание GNA для этих гликанов намного ниже (Kaku et al. , 1990). По сравнению с SSA, RSA отдает предпочтение концевым невосстанавливающим остаткам GalNAc (Skamnaki et al., 2013). Тем не менее, наши данные были ясны в том факте, что между этими двумя типами клеток можно было наблюдать разницу в поляризации распределения гликанов.Действительно, мы наблюдали равномерное распределение флуоресценции по клеточной поверхности в стволовых клетках, в то время как дифференцированные столбчатые клетки показали четкую поляризацию связывания лектина. Таким образом, можно сделать вывод, что дифференцировка связана с поляризацией и что эта поляризация связана с различиями в распределении гликанов. Кроме того, было интересно отметить, что в тех же условиях, что и с столбчатыми клетками, связывание SNA-I было незначительным по периметру стволовых клеток средней кишки.Мы считаем, что представляет интерес дальнейшая проверка этого наблюдения для потенциального использования этого лектина [SNA-I, связывающего Neu5Ac(α-2,6)Gal/GalNAc] в качестве маркера для дифференцированных клеток. Следовательно, наши данные являются первым шагом на пути к лучшему пониманию важности паттернов гликозилирования для развития средней кишки насекомых, особенно в отношении клеточной полярности и процесса дифференцировки.

Вклад авторов

TW, KD и KC выполнили экспериментальный анализ.EV и GS руководили исследованием и участвовали в критическом анализе данных, корректировке рукописи и обсуждениях. Все авторы внесли свой вклад в написание рукописи. Все авторы прочитали и одобрили окончательный вариант рукописи.

Финансирование

Этот проект был поддержан Фондом специальных исследований Гентского университета, Фондом Геркулеса и Фламандским государственным агентством по инновациям в науке и технологиях (IWT, Брюссель).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Дидье Ван де Вельде за помощь в выращивании насекомых S. littoralis .

Ссылки

Альфала М., Джейкоб Р., Прейсс У., Циммер К.П., Наим Х. и Наим Х.Ю. (1999). О-связанные гликаны опосредуют апикальную сортировку сахаразы-изомальтазы кишечника человека посредством ассоциации с липидными рафтами. Курс. Биол . 9, 593–596. дои: 10.1016/S0960-9822(99)80263-2

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Андерсон, Д.M., Ablonczy, Z., Koutalos, Y., Spraggins, J., Crouch, R.K., Caprioli, R.M., et al. (2014). Масс-спектрометрия MALDI с высоким разрешением липидов ткани сетчатки. Дж. Ам. соц. Масс-спектр . 25, 1394–1403. doi: 10.1007/s13361-014-0883-2

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ангелуччи, К., Барретт-Уилт, Г. А., Хант, Д. Ф., Ахерст, Р. Дж., Ист, П. Д., Гордон, К. Х., и соавт. (2008). Разнообразие аминопептидаз, полученных из четырех дупликаций генов чешуекрылых, и поликалинов, экспрессируемых в средней кишке Helicoverpa armigera : идентификация белков, связывающих δ-эндотоксин, Cry1Ac Bacillus thuringiensis . Биохимия насекомых. Мол. Биол . 38, 685–696. doi: 10.1016/j.ibmb.2008.03.010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аоки К., Перлман М., Лим Дж. М., Канту Р., Уэллс Л. и Тимейер М. (2007). Динамическое развитие сложности N-связанного гликана у эмбриона Drosophila melanogaster . Дж. Биол. Химия . 282, 9127–9142. doi: 10.1074/jbc.M606711200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Аоки, К., Porterfield, M., Lee, S.S., Dong, B., Nguyen, K., McGlamry, K.H., et al. (2008). Разнообразие O-связанных гликанов, экспрессируемых во время развития Drosophila melanogaster , отражает стадийно- и тканеспецифические требования к клеточной передаче сигналов. Дж. Биол. Химия . 283, 30385–30400. дои: 10.1074/jbc.M804925200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Брэдфорд, Массачусетс (1976). Быстрый и чувствительный метод количественного определения белка в микрограммах, использующий принцип связывания белка с красителем. Анал. Биохим . 72, 248–254. дои: 10.1016/0003-2697(76)-3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Caccia, S., Van Damme, EJM, De Vos, WH, and Smaghe, G. (2012). Механизм энтомотоксичности растительного лектина гибрида Hippeastrum (Amaryllis) у личинок Spodoptera littoralis . J. Физиол насекомых . 58, 1177–1183. doi: 10.1016/j.jinsphys.2012.05.014

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Черменати, Г., Corti, P., Caccia, S., Giordana, B., and Casartelli, M. (2007). Морфологическая и функциональная характеристика клеток средней кишки личинок Bombyx mori в культуре. Выживание беспозвоночных. Дж . 4, 119–126.

Академия Google

Чауран, П., Шривер, К. Э., и Каприоли, Р. М. (2007). Дизайн и характеристики прибора для MALDI-MS визуализации срезов тканей с высоким разрешением. Дж. Масс-спектр . 42, 476–489. doi: 10.1002/jms.1180

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен Ю. W., Pedersen, J.W., Wandall, H.H., Levery, S.B., Pizette, S., Clausen, H., et al. (2007). Гликосфинголипиды с удлиненной сахарной цепью выполняют специализированные функции в развитии и поведении дрозофилы. Дев. Биол . 306, 736–749. doi: 10.1016/j.ydbio.2007.04.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кристофолетти, П. Т., Рахбе, Ю., и Терра, В. Р. (2006). Характеристика мембраносвязанной аминопептидазы, очищенной из клеток средней кишки Acyrthosiphon pisum . ФЕБС J . 273, 5574–5588. doi: 10.1111/j.1742-4658.2006.05547.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Додзима Т., Нишина Т., Като Т., Уно Т., Яги Х., Като К. и др. (2009). Сравнение N-связанного гликозилирования β1 человека, 3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы 2, экспрессируемой в клетках насекомых и личинках тутового шелкопряда. Дж. Биотехнология . 143, 27–33. doi: 10.1016/j.jbiotec.2009.06.013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Фитчс, Э. , Wiles, D., Douglas, A.E., Hinchliffe, G., Audsley, N., and Gatehouse, J.A. (2008). Инсектицидная активность рекомбинантных лектинов чеснока по отношению к тлям. Биохимия насекомых. Мол. Биол . 38, 905–915. doi: 10.1016/j.ibmb.2008.07.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Fitches, E., Woodhouse, S.D., Edwards, J.P., and Gatehouse, J.A. (2001). In vitro и in vivo связывание лектинов подснежника ( Galanthus nivalis агглютинин; GNA) и фасоли ( Canavalia ensiformis ; Con A) в личинках томатной моли ( Lacanobia oleracea 😉 механизмы инсектицидного действия. J. Физиол насекомых . 47, 777–787. doi: 10.1016/S0022-1910(01)00068-3

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гут, А., Каппелер, Ф., Хайка, Н., Балда, М.С., Хаури, Х.П., и Маттер, К. (1998). Гольджи, опосредованный углеводами, для транспорта на клеточной поверхности и апикального нацеливания на мембранные белки. EMBO J . 17, 1919–1929. doi: 10.1093/emboj/17.7.1919

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гуттернигг, М., Бургмайр, С., Пёлтль, Г., Рудольф, Дж., и Штаудахер, Э. (2007). Структура нейтрального N-гликана брюхоногих моллюсков Limax maximus, Cepaea hortensis, Planorbarius corneus, Arianta arbustorum и Achatina fulica . Гликоконж. Дж . 24, 475–489. doi: 10.1007/s10719-007-9040-5

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хаким, Р. С., Болдуин, К., и Смагге, Г. (2010). Регуляция роста, развития и метаморфоза средней кишки. Энн. Преподобный Энтомол . 55, 593–608. doi: 10.1146/annurev-ento-112408-085450

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хамшоу, М., Смагге, Г., Шахиди-Ногаби, С., Де Гейтер, Э., Ланну, Н., и Ван Дамм, Э. Дж. (2010a). Инсектицидные свойства агглютинина Sclerotinia sclerotiorum и его взаимодействие с тканями и клетками насекомых. Биохимия насекомых. Мол . Биол . 40, 883–890. doi: 10.1016/j.ibmb.2010.08.008

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Хамшоу, М., Ван Дамм, Э.Дж., и Смагге, Г. (2010b). Энтомотоксические эффекты лектина грибов от Rhizoctonia solani к Spodoptera littoralis . Грибковый биол . 114, 34–40. doi: 10.1016/j.mycres.2009.10.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hamshou, M., Van Damme, E.J., Caccia, S., Cappelle, K., Vandenborre, G., Ghesquiere, B., et al. (2013). Высокая энтомотоксичность и механизм действия грибкового GalNAc/Gal-специфического лектина Rhizoctonia solani у насекомых-вредителей. J. Физиол насекомых . 59, 295–305. doi: 10.1016/j.jinsphys.2012.12.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hamshou, M., Van Damme, E.J., Vandenborre, G., Ghesquière, B., Trooskens, G., Gevaert, K., et al. (2012). GalNAc/Gal-связывающий агглютинин Rhizoctonia solani обладает антипролиферативной активностью в клетках Drosophila melanogaster S2 посредством передачи сигналов MAPK и JAK/STAT. PLoS ONE 7:e33680. doi: 10.1371/журнал.пон.0033680

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хегедус, Д., Эрландсон, М., Гиллот, К., и Топрак, У. (2009). Новое понимание синтеза, архитектуры и функций перитрофической матрицы. Энн. Преподобный Энтомол . 54, 285–302. doi: 10.1146/annurev.ento.54.110807.0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Эрреро, С., Ансемс, М., Ван Эрс, М.М., Влак, Дж.М., Баккер, П.Л., и де Маагд, Р.А. (2007).REPAT, новое семейство белков, индуцируемых бактериальными токсинами и бакуловирусной инфекцией у Spodoptera exigua . Биохимия насекомых. Мол. Биол . 37, 1109–1118. doi: 10.1016/j.ibmb.2007.06.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Holland, JW, Deeth, HC, and Alewood, PF (2005). Анализ занятости сайтов O-гликозилирования в гликоформах κ-казеина крупного рогатого скота, разделенных двумерным гель-электрофорезом. Протеомика 5, 990–1002.doi: 10.1002/pmic.200401098

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Холлистер Дж., Конрад Х. и Джарвис Д.Л. (2003). Доказательства пути утилизации сиаловой кислоты в клетках чешуекрылых насекомых. Гликобиология 13, 487–495. doi: 10.1093/гликоб/cwg053

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Huet, G., Gouyer, V., Delacour, D., Richet, C., Zanetta, J.P., Delannoy, P., et al. (2003). Участие гликозилирования во внутриклеточном транспорте гликопротеинов в поляризованных эпителиальных клетках. Биохимия 85, 323–330. doi: 10.1016/S0300-9084(03)00056-7

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ига, М., и Смагге, Г. (2011). Взаимосвязь между метаморфозом личинки и куколки и экспрессией транскриптов инсулиноподобного пептида и рецептора инсулина у Spodoptera littoralis . Пептиды 32, 531–538. doi: 10.1016/j.peptides.2010.10.033

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ислам, р., Накамура М., Скотт Х., Репникова Э., Карнахан М., Панди Д. и соавт. (2013). Роль Drosophila cytidine монофосфатсинтетазы сиаловой кислоты в нервной системе. Дж. Нейроски . 33, 12306–12315. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5220-12.2013

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йохсвич, А., Крафт, Б., Вурер, М., Бергер, М., Дилдер, А. М., Хокке, С. Х., и соавт. (2009). Для нацеливания Гольджи на Drosophila melanogaster β4GalNAcTB требуется белок, родственный семейству белков DHHC, в качестве пилотного. J. Cell Biol . 184, 173–183. doi: 10.1083/jcb.200801071

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Джурат-Фуэнтес, Дж. Л., и Аданг, М. Дж. (2004). Характеристика Cry1Ac-рецептора щелочной фосфатазы у восприимчивых и устойчивых личинок Heliothis virescens . евро. Дж. Биохим . 271, 3127–3135. doi: 10.1111/j.1432-1033.2004.04238.x

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кадзиура, Х., Хамагути Ю., Мидзусима Х., Мисаки Р. и Фудзияма К. (2015). Потенциалы сиалирования тутового шелкопряда, Bombyx mori ; B. mori обладает активной α2,6-сиалилтрансферазой. Гликобиология 25, 1441–1453. doi: 10.1093/гликоб/cwv060

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Каку, Х., Ван Дамм, Э. Дж., Пеуманс, В. Дж., и Гольдштейн, И. Дж. (1990). Специфичность связывания углеводов у нарцисса (Narcissus pseudonarcissus) и амариллиса (Hippeastrum hybr.) лектины луковиц. Арх. Биохим. Биофиз . 279, 298–304. дои: 10.1016/0003-9861(90)

-К

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Kim, S., Hwang, S.K., Dwek, R.A., Rudd, P.M., Ahn, Y.H., Kim, E.H., et al. (2003). Структурное определение N-гликанов арилфорина чешуекрылых выявляет присутствие моноглюкозилированного олигосахарида в запасном белке. Гликобиология 13, 147–157. doi: 10.1093/гликоб/cwg023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Найт, П.Дж., Кэрролл, Дж., и Эллар, Д.Дж. (2004). Анализ гликановых структур на аминопептидазе N 120 кДа Manduca sexta и их взаимодействия с токсином Bacillus thuringiensis Cry1Ac. Биохимия насекомых. Мол. Биол . 34, 101–112. doi: 10.1016/j.ibmb.2003.09.007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Колес К., Репникова Е., Павлова Г., Корочкин Л. И., Панин В. М. (2009). Сиалилирование у первичноротых: взгляд с точки зрения генетики и биохимии дрозофилы. Гликоконж. Дж . 26, 313–324. doi: 10.1007/s10719-008-9154-4

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кундури, Г., Юань, К., Партибане, В., Нисванер, К.М., Канвар, Р., Нагашима, К., и др. (2014). Фосфолипаза A1 фосфатидной кислоты опосредует транзит ER-Golgi семейства рецепторов, связанных с G-белком. J. Cell Biol . 206, 79–95. doi: 10.1083/jcb.201405020

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Курц, С., Aoki, K., Jin, C., Karlsson, N.G., Tiemeyer, M., Wilson, I.B., et al. (2015). При направленном высвобождении и фракционировании выявляют глюкуронилированные и сульфатированные N- и O-гликаны в личинках двукрылых насекомых. J. Протеомика 126, 172–188. doi: 10.1016/j.jprot.2015.05.030

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лехейн, М.Дж., и Биллингсли, П.Ф. (1996). Биология средней кишки насекомых, 1-е изд. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Чепмен и Холл.

Академия Google

Леб, М.Дж., Кларк Э.А., Блэкберн М., Хаким Р.С., Эльсен К. и Смагге Г. (2003). Стволовые клетки из средней кишки личинок чешуекрылых : ключи к регуляции судьбы стволовых клеток. Арх. Биохимия насекомых. Физиол . 53, 186–198. doi: 10.1002/arch.10098

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мортимер, Н. Т., Качох, Б.З., Кибо, Э.С., и Шленке, Т.А. (2012). Mgat1-зависимое N-гликозилирование компонентов мембран запускает клетки крови Drosophila melanogaster для реакции клеточной инкапсуляции. ПлоС Патог . 8:e1002819. doi: 10.1371/journal.ppat.1002819

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мун, Дж. Й., Ли, К. Дж., Ким, Й. Дж., Квон, О., Ким, С. Дж., Ли, С. Г., и др. (2012). Разработка флуоресцентных зондов для обнаружения фукозилированных N-гликанов с использованием лектина Aspergillus oryzae . Заяв. микробиол. Биотехнолог . 93, 251–260. doi: 10.1007/s00253-011-3549-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нин, К., Ву, К., Лю, К., Гао, Ю., Джурат-Фуэнтес, Дж. Л., и Гао, X. (2010). Характеристика щелочной фосфатазы, связывающей токсин Cry1Ac, в средней кишке личинок Helicoverpa armigera (Hübner). J. Физиол насекомых . 56, 666–672. doi: 10.1016/j. jinsphys.2010.02.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Нинг, X., Го, Дж., Вольферт, М.А., и Бунс, Г.Дж. (2008). Визуализация метаболически меченых гликоконъюгатов живых клеток с помощью не содержащих медь и быстрых циклоприсоединений Хьюсгена . Анжю. Химия . 47, 2253–2255. doi: 10.1002/anie.200705456

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Перера, О.П., Уиллис, Дж.Д., Аданг, М.Дж., и Джурат-Фуэнтес, Дж.Л. (2009). Клонирование и характеристика Cry1Ac-связывающей щелочной фосфатазы (HvALP) из Heliothis virescens . Биохимия насекомых. Мол. Биол . 39, 294–302. doi: 10.1016/j.ibmb.2009.01.006

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пизет, С., Rabouille, C., Cohen, S.M., and Therond, P. (2009). Гликосфинголипиды контролируют внеклеточный градиент лиганда Gurken EGFR дрозофилы. Разработка 136, 551–561. doi: 10.1242/dev.031104

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Поттер, Б. А., Хьюи, Р. П., и Вайс, О. А. (2006). Роль N- и O-гликанов в поляризованной биосинтетической сортировке. утра. Дж. Физиол. Селл Физиол . 290, С1–С10. doi: 10.1152/ajpcell.00333.2005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пауэлл, К.С., Спенс Дж., Бхарати М., Гейтхаус Дж. А. и Гейтхаус А. М. Р. (1998). Иммуногистохимические исследования и исследования развития для выяснения механизма действия лектина подснежника на бурую личинку, Nilaparvata lugens (Stal). J. Физиол насекомых . 44, 529–539. дои: 10.1016/S0022-1910(98)00054-7

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ракус, Дж. Ф., и Махал, Л. К. (2011). Новые технологии гликомного анализа: к систематическому пониманию гликома. Энн. Преподобный Анал. Химия . 4, 367–392. doi: 10.1146/annurev-anchem-061010-113951

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рендич, Д. , Уилсон, И.Б., и Пашингер, К. (2008). Гликозилирующая способность клеток насекомых. хорват. Химия . Acta 81, 7–21.

Академия Google

Репникова Э., Колес К., Накамура М., Питтс Дж., Ли Х., Амбаване А. и соавт. (2010). Сиалилтрансфераза регулирует функцию нервной системы у дрозофилы. Дж. Нейроски . 30, 6466–6476. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5253-09.2010

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Родриго-Симон, А., Качча, С., и Ферре, Дж. (2008). Bacillus thuringiensis Cry1Ac токсин-связывающая и порообразующая активность в мембранных пузырьках щеточной каймы, полученных из передней и задней областей средней кишки личинок чешуекрылых. Заяв. Окружающая среда. Микробиол . 74, 1710–1716 гг. doi: 10.1128/AEM.02827-07

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Рот, Дж., Kempf, A., Reuter, G., Schauer, R., and Gehring, W.J. (1992). Наличие сиаловых кислот у Drosophila melanogaster . Наука 256, 673–675. doi: 10.1126/science.1585182

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Саркар, М., Левентис, П.А., Силвеску, К.И., Рейнхольд, В.Н., Шахтер, Х., и Булианн, Г.Л. (2006). Нулевые мутации в N-ацетилглюкозаминилтрансферазе I дрозофилы вызывают дефекты передвижения и сокращение продолжительности жизни. Дж. Биол. Химия . 281, 12776–12785. doi: 10.1074/jbc.M512769200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шак, С., и Саймонс, К. (2004). Поляризованная сортировка в эпителиальных клетках: кластеризация рафтов и биогенез апикальной мембраны. J. Cell Sci . 117, 5955–5964. doi: 10.1242/jcs.01596

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Шахиди-Ногаби, С., Ван Дамм, Э. Дж., и Смагге, Г. (2008).Углеводсвязывающая активность инактивирующего рибосомы белка SNA-I типа 2 из бузины ( Sambucus nigra ) является определяющим фактором его инсектицидной активности. Фитохимия 69, 2972–2978. doi: 10.1016/j.phytochem.2008.09.012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Skamnaki, V.T., Peumans, WJ, Kantsadi, A.L., Cubeta, M.C., Plas, K., Pakala, S., et al. (2013). Структурный анализ агглютинина Rhizoctonia solani выявляет димерную сборку с заменой доменов. ФЕБС J . 280, 1750–1763 гг. дои: 10.1111/февраль 12190

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Смагге, Г., Ванхассел, В., Муреманс, К., Де Уайлд, Д., Гото, С., и Леб, М. Дж. (2006). Стимуляция пролиферации и дифференцировки стволовых клеток средней кишки гормонами и пептидами насекомых. Энн. Академик Нью-Йорка Наука . 1040, 472–475. doi: 10.1196/annals.1327.094

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Сайед, З.A., Bougé, A.L., Byri, S., Chavoshi, T.M., Tång, E., Bouhin, H., et al. (2012). Люминальный гликопротеин вызывает дозозависимое увеличение диаметра трубки задней кишки Drosophila melanogaster . ПЛОС Жене . 8:e1002850. doi: 10.1371/journal.pgen.1002850

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Теопольд У., Самаковлис К., Эрджумент-Бромейдж Х., Диллон Н., Аксельссон Б., Шмидт О. и др. (1996). Лектин Helix pomatia, индуктор иммунного ответа дрозофилы, связывается с гемомуцином, новым поверхностным муцином. Дж. Биол. Химия . 271, 12708–12715. doi: 10.1074/jbc.271.22.12708

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Тиан, Э., и Тен Хаген, К.Г. (2007b). UDP-GalNAc: полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансферазы необходим для образования эпителиальных трубок. Дж. Биол. Химия . 282, 606–614. doi: 10.1074/jbc.M606268200

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Топрак, У., Болдуин, Д., Эрландсон, М., Гиллот, К., Харрис С. и Хегедус Д. Д. (2010a). Паттерны экспрессии генов, кодирующих белки с доменами перитрофина а, и локализация белков у Mamestra configurata. Дж . Физиол насекомых . 56, 1711–1720 гг. doi: 10.1016/j.jinsphys.2010.06.016

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Топрак У., Болдуин Д., Эрландсон М., Гиллот С. и Хегедус Д. Д. (2010b). Муцины кишечника насекомых и сериновые протеазы, связанные с перитрофическим матриксом от питающихся, голодающих и линяющих личинок Mamestra configurata . Мол насекомого . Биол . 19, 163–175. doi: 10.1111/j.1365-2583.2009.00966.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Тран, Д. Т., Чжан, Л., Чжан, Ю., Тиан, Э., Эрл, Л. А., и Тен Хаген, К. Г. (2012). Несколько членов семейства UDP-GalNAc: полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансферазы необходимы для жизнеспособности дрозофилы. Дж. Биол. Химия . 287, 5243–5252. doi: 10.1074/jbc.M111.306159

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван Дамм, Э.Дж. М., Аллен А. К. и Пиманс В. Дж. (1988). Родственные маннозоспецифические лектины разных видов семейства Amaryllidaceae. Физиол. Завод . 73, 52–57. doi: 10.1111/j.1399-3054.1988.tb09192.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ван Дамм, Э. Дж., Барре, А., Руже, П., Ван Левен, Ф., Бальзарини, Дж., и Пиманс, В. Дж. (1996). Молекулярное клонирование лектина и родственного лектину белка обыкновенного тюленя Соломона ( Polygonatum multiflorum ). Завод Мол. Биол . 31, 657–672. дои: 10.1007/BF00042237

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Van Damme, EJM, Peumans, WJ, Barre, A., and Rouge, P. (1998). Лектины растений: смесь нескольких различных семейств структурно и эволюционно родственных белков с разнообразными биологическими ролями. CRC крит. Rev. Plant Sci . 17, 575–692. дои: 10.1080/073526898276

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Ванкова, М., Стерба Дж., Дупейова Дж., Симонова З., Небесарова Дж., Новотный М.В., и соавт. (2012). Поглощение и включение сиаловой кислоты клещом Ixodes ricinus . J. Физиол насекомых . 58, 1277–1287. doi: 10.1016/j.jinsphys.2012.06.016

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Vandenborre, G., Lannoo, N., Smaghe, G., Daniel, E., Breite, A., Soin, T., et al. (2008). Бесклеточная экспрессия и анализ функциональности табачного лектина. Клетка in vitro.Дев. биол. Аним . 44, 228–235. doi: 10.1007/s11626-008-9123-z

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ванденборре, Г., Мирш, О., Хаузе, Б., Смагге, Г., Вастернак, К., и Ван Дамм, Э. Дж. (2009). Spodoptera littoralis -индуцированная экспрессия лектина в табаке. Физиол растительных клеток . 50, 1142–1155. doi: 10.1093/pcp/pcp065

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Варки А. и Лоу Дж.Б. (2009). «Биологические роли гликанов», в Essentials of Glycobiology 2nd Edn. , редакторы А. Варки, Р. Д. Каммингс, Дж. Д. Эско, Х. Х. Фриз, П. Стэнли, К. Р. Бертоцци, Г. В. Харт и М. Э. Эцлер (Колд-Спринг-Харбор: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор), 6.

Академия Google

Варки, А., Каммингс, Р. Д., Эско, Дж. Д., Фриз, Х. Х., Стэнли, П., Бертоцци, С. Р., и соавт. (2009). «Открытие и классификация гликансвязывающих белков», в Essentials of Glycobiology 2nd Edn., редакторы А. Варки, Р. Д. Каммингс, Дж. Д. Эско, Х. Х. Фриз, П. Стэнли, К. Р. Бертоцци, Г. В. Харт и М. Э. Эцлер (Колд-Спринг-Харбор: Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор), 24.

Verlinden, H., Vleugels, R., Verdonck, R., Urlacher, E., Vanden Broeck, J., and Mercer, A. (2014). Фармакологические и сигнальные свойства D2-подобного дофаминового рецептора (Dop3) в Tribolium castaneum . Биохимия насекомых. Мол. Биол . 56, 9–20. doi: 10.1016/j.ibmb.2014.11.002

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вальски, Т., Де Шуттер, К., Ван Дамм, Э.Дж., и Смагге, Г. (2017). Разнообразие и функции гликозилирования белков у насекомых. Биохимия насекомых. Мол. Биол . 83, 21–34. doi: 10.1016/j.ibmb.2017.02.005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вальски, Т., Ван Дамм, Э.Дж.М., и Смагге, Г. (2014). Проникновение через перитрофический матрикс является ключом к токсичности лектина против Tribolium castaneum . J. Физиол насекомых . 70, 94–101.doi: 10.1016/j.jinsphys.2014.09.004

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вальски, Т., Ван Дамм, Э. Дж., Смаргиассо, Н., Кристианс, О., Де Пау, Э., и Смагге, Г. (2016). N-гликозилирование белка и обрезка N-гликанов необходимы для постэмбрионального развития жука-вредителя Tribolium castaneum . науч. Реп . 6:35151. дои: 10.1038/srep35151

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Йемен, К., Ле Галл, А. Х., Болдуин, А. Н., Монлозер, Л. , Ле Бивик, А., и Родригес-Булан, Э. (1997). O-гликозилированный стеблевой домен необходим для апикальной сортировки рецепторов нейротрофинов в поляризованных клетках MDCK. J. Cell Biol . 139, 929–940. doi: 10.1083/jcb.139.4.929

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Разработка устойчивых к насекомым растений кукурузы, экспрессирующих ген хитиназы хлопкового листового червя Spodoptera littoralis

Oerke, E-C.Потери урожая от вредителей. Дж. Агр. науч. 144, 31–43 (2006).

Google Scholar

Godfray, H.C.J. et al. Продовольственная безопасность: задача накормить 9 миллиардов человек. Наука 327, 812–818 (2010).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Э.Л.-Гариеб, Д., Осман, Г.Х. и Эль-баз, А.Ф. Выделение, клонирование и сверхэкспрессия гена vip3Aa, выделенного из местного Bacillus thuringiensis . наук о биоконтроле. Техн. 22, 11–21 (2012).

Артикул Google Scholar

Осман Г. и др. Биоинсектицид Bacillus thuringiensis Всесторонний обзор. Египет J Biol Борьба с вредителями. 25, 1 (2015).

Google Scholar

Абулриш, Х. Х., Осман, Г. Х. и Ассаеди, А. Х. Характеристика инсектицидных генов штаммов Bacillus thuringiensis , выделенных из засушливых сред. Индийский J. Microbiol. 52, 500–503, (2012).

КАС Google Scholar

Эль-Менофи, У. Х., Осман, Г. Х., Ассаеди, А. и Салама М. С. Конструирование нового рекомбинантного бакуловируса, содержащего инсектицидный белок Cry1Ab, из Bacillus thuringiensis . Биол Проведено онлайн. 16, 7 (2014).

Артикул Google Scholar

Чжу, К., Аракан Ю., Биман Р. В., Крамер К.Дж. и Мутукришнан С. Характеристика рекомбинантных хитиназоподобных белков Drosophila melanogaster и Tribolium castaneum . Биохимия насекомых. молек. 38, 467–477 (2008).

КАС Статья Google Scholar

Аракан Ю. и Мутукришнан С. Хитиназа насекомых и хитиназоподобные белки. Клетка. Мол. Жизнь наук. 67, 201–216 (2010).

КАС Статья Google Scholar

Регев А.и другие. Синергическая активность δ-эндотоксина Bacillus thuringiensis и бактериальной эндохитиназы против личинок S. littoralis . заявл. Окружающая среда. микроб. 26, 3581–3585 (1996).

Google Scholar

Шреста, К.Л., Она, И., Мутукришнан, С. и Мью, Т.В. Уровни хитиназы в сортах риса коррелируют с устойчивостью к возбудителю влагалищной гнили Rhizoctonia solani . Евро. Дж. Плант Патол. 120, 69–77 (2008).

КАС Статья Google Scholar

Лехейн, М. Дж. Перитрофическая матричная структура и функция. Аня. Преподобный Энтомол. 42, 525–550 (1997).

КАС Статья Google Scholar

Jasrapuria, S. et al. Гены, кодирующие белки с хитин-связывающими доменами типа перитрофина А в Tribolium castaneum , сгруппированы в три отдельных семейства на основе филогении, экспрессии и функции.Биохимия насекомых. молек. 40, 214–227 (2010).

КАС Статья Google Scholar

Zhu, Q., Arakane, Y., Beeman, R.W., Kramer, K.J. & Muthukrishnan, S. Функциональная специализация генов семейства хитиназ насекомых, выявленная с помощью РНК-интерференции. ПНАС 105, 6650–6655 (2008).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Фукамизо Т. Хитилинолитические ферменты: катализ, связывание субстрата и их применение.Курс. Белковый пепт. науч. 1, 105–124 (2000).

КАС Статья Google Scholar

Гопалакришнан, Б., Мутукришнан, С. и Крамер, К.Дж. Опосредованная бакуловирусом экспрессия гена хитиназы Manduca sexta : свойства рекомбинантного белка. Биохимия насекомых. молек. 25, 255–265 (1995).

КАС Статья Google Scholar

Осман Г., Хусейн, Э.М. и Абдалла, Н.А. Характеристика и очистка хитинолитического фермента, активного против S. cretica (розовый мотылек). Араб Дж. Биотехнолог. 7, 65–74 (2004).

Google Scholar

Морейра, М. Ф. и др. Хитиноподобный компонент Aedes aegypti яичной скорлупы, яиц и яичников. Биохимия насекомых. молек. 37, 1249–1262 (2007).

КАС Статья Google Scholar

Крамер, К. J. & Muthukrishnan, S. Метаболизм хитина у насекомых в Комплексная молекулярная наука о насекомых . Том. 4 Гилберт Л.И., Ятроу К. и Гилл С.С. (ред.) 111–144 (Elsevier BV, 2005).

Google Scholar

Виват, К., Тайтанун, С., Пантуватана, С. и Бхумиратана, А. Токсичность -продуцента хитиназы Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-1 (G) к Plutella xylostella . Дж. Инвертебр.Патол. 76, 270–277 (2000).

КАС Статья Google Scholar

Smirnoff, W. A. & Valero, J. R. Метаболические нарушения у Choristoneura fumiferana Clemens , инфицированных Bacillus thuringiensis отдельно или с добавлением хитиназы. Преподобный Кан. биол. 31, 163–169 (1972).

КАС пабмед Google Scholar

Лысенко О. Хитиназа Serratia marcescens и ее токсичность для насекомых.Дж. Инверт. Патол. 27, 385–386 (1976).

КАС Статья Google Scholar

Ornatowski, W. et al. Введение и конститутивная экспрессия гена хитиназы табачного рогатого червя ( Manduca sexta ) в сое. Клетка in vitro. Дев. пл. 40, 260–265 (2004).

КАС Статья Google Scholar

Zhu, Q. et al. Компьютерная идентификация новых хитиназоподобных белков в геноме Drosophila melanogaster .Биоинформатика 20, 161–169 (2004).

КАС Статья Google Scholar

Shinoda, T., Kobayashi, J., Matsui, M. & Chinzei, Y. Клонирование и функциональная экспрессия кДНК хитиназы из обыкновенной совки, S. litura , с использованием рекомбинантного бакуловируса, лишенного вируса- кодирует ген хитиназы. Биохимия насекомых. Молец 31, 521–532 (2001).

КАС Статья Google Scholar

Болоньези, Р. и другие. Последовательности кДНК и экспрессия генов, кодирующих хитинсинтазу и хитиназу, в средней кишке S. frugiperda. Биохимия насекомых. молек. 35, 1249–1259 (2005).

КАС Статья Google Scholar

Дин, X. и др. Устойчивость к насекомым трансгенного табака, экспрессирующего ген хитиназы насекомых. Трансгенный Рез. 7, 77–84 (1998).

КАС Статья Google Scholar

Ван, Х.и другие. Характеристика хитиназы насекомых с молекулярной массой 46 кДа из трансгенного табака. Биохимия насекомых. молек. 26, 1055–1064 (1996).

КАС Статья Google Scholar

McCafferty, H. R., Moore, P. H. & Zhu, Y. J. Повышение устойчивости Carica papaya к карминовому паутинному клещу за счет экспрессии трансгена хитиназы Manduca sexta . Трансгенный Рез. 15, 337–47 (2006).

КАС Статья Google Scholar

Сагес, Дж. и другие. Неожиданное воздействие хитиназ на персиково-картофельную тлю ( Myzus persicae Sulzer) при доставке через трансгенные растения картофеля ( Solanum tuberosum Linne) и in vitro . Трансгенный Рез. 14, 57–67 (2005).

КАС Статья Google Scholar

Merzendorfer, H. Хитиназы, полученные из насекомых. Adv Biochem Eng Biotechno. 136, 19–50 (2013).

Джонс, Дж. Д. Г., Грейди, К.Л., Суслоу Т.В. и Бедбрук Дж.Р. Выделение и характеристика генов, кодирующих два фермента хитиназы из Serratia marcescens . EMBO J5, 467–473 (1986).

Артикул Google Scholar

Оппенгейм, А. Б. и Чет, И. Клонированные хитиназы в стратегиях борьбы с грибковыми растениями и патогенами. Тенденции биотехнологии. 70, 392–394 (1992).

Артикул Google Scholar

Сундхейм, Л. Биоконтроль Fusarium oxysporum с помощью гена, кодирующего хитиназу, из Sermtia marcescens на стабильной плазмиде Pseudomonas. Джей Селл Биохим. 13А, 171 (1990).

Google Scholar

Ли и др. Колонизация арбускулярным микоризным грибом Glomus versiforme вызывает защитный ответ против галловой нематоды Meloidogyne incognita в виноградной лозе ( Vitis amurensis Rupr. ), который включает транскрипционную активацию гена хитиназы класса III VCh4.Физиология клеток растений. 47, 154–163 (2006).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Sambrook, J. & Russell, D.W. Получение плазмидной ДНК путем щелочного лизиса с SDS: Minipreparation in Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edn. Сэмбрук, Дж. и Рассел, Д.В. (ред.) 1.32–1.34 (Нью-Йорк, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1975).

Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. Биохимия ДНК-секвенирование с ингибиторами обрыва цепи (ДНК-полимераза/нуклеотидная последовательность/бактериофаг 4X174).ПНАС 74, 5463–5467 (1977).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Green, C.E. & Phillips, R.L. Регенерация растений из тканевых культур кукурузы. Растениеводство. 15, 417–421 (1975).

Артикул Google Scholar

Чу, К.К. и другие. Создание эффективной среды для выращивания пыльников риса посредством сравнительных экспериментов с источниками азота.Научно-китайская математика. 18, 659–668 (1975).

Google Scholar

Асем, С.К. Производство каллуса и регенерация растений у египетских генотипов кукурузы. Араб Дж. Биотехнолог. 4, 247–256 (2001).

Google Scholar

Эль-Итриби, Х.А. и другие. Регенерация и трансформация инбредных линий египетской кукурузы с помощью культуры незрелых зародышей и системы доставки биолистических частиц. Клетка in vitro. Дев. пл. 39, 524–531 (2003).

Артикул Google Scholar

Zhong, H. et al. Анализ функциональной активности 1,4 Kb 5′-области гена актина l риса в стабильных трансгенных растениях кукурузы ( Zea mays L.). Растениевод. 116, 73–84 (1996).

КАС Статья Google Scholar

Laemmli, U.K. Расщепление структурных белков при сборке головки бактериофага Т4.Природа 227, 680–685 (1970).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Тоубин, Х., Стахелин, Т. и Гордон, Дж. Электрофорезный перенос белков из полиакриламидных гелей в листы нитроцеллюлозы: процедура и некоторые приложения. ПНАС 76, 4350–4354 (1979).

КАС ОБЪЯВЛЕНИЯ Статья Google Scholar

Бернетт В. «Вестерн-блоттинг»; Электрофорезный перенос белков из полиакриламидных гелей с додецилсульфатом натрия на немодифицированную нитроцеллюлозу и радиографическое обнаружение с антителами и радиоактивным йодом. Анальный. Биохим. 112, 195–203 (1988).

Артикул Google Scholar

In Vivo Pyro-SIP Оценка активной микробиоты кишечника хлопковой листовертки, Spodoptera littoralis

Abstract

Микробиота кишечника имеет решающее значение для хозяина со значительной метаболической активностью. Хотя были предприняты большие усилия для характеристики микробного разнообразия, измерение метаболической активности компонентов, как ни странно, не поспевает за ними.Здесь мы объединили пиросеквенирование амплифицированных генов 16S рРНК с зондированием стабильных изотопов in vivo (Pyro-SIP), чтобы выявить метаболически активные бактерии в кишечнике хлопковой листовертки ( Spodoptera littoralis ), многоядного травоядного насекомого, потребляющего большое количество растений. материал за короткое время, высвобождая большое количество глюкозы в пищеварительном тракте как наиболее важный источник углерода и энергии как для хозяина, так и для активных кишечных бактерий. Используя глюкозу ¹³ C в качестве трофического звена, Pyro-SIP показал, что относительно простая, но характерная кишечная микробиота развивается совместно с хозяином, причем как метаболическая активность, так и состав меняются на протяжении личиночных стадий. Pantoea , Citrobacter и Clostridium были особенно активны на ранних стадиях развития, вероятно, основные функциональные популяции, связанные с улучшением питания. Enterococcus был единственным преобладающим родом в сообществе, и он был практически стабилен и метаболически активен в течение всей жизни личинок. Основываясь на том, что энтерококки образовывали слои, подобные биопленкам, на эпителии кишечника, и что выделенные штаммы проявляли противомикробные свойства, энтерококков могут быть в состоянии установить эффект резистентности к колонизации в кишечнике против потенциально вредных микробов извне.Это не только первая подробная инвентаризация кишечной микробиоты модельного организма из чешуекрылых, в основном фитофагов, но и это экспериментальное исследование показывает, что Pyro-SIP может быстро получить представление о метаболической активности кишечной микробиоты с высоким разрешением и высокой точностью. .

Образец цитирования: Shao Y, Arias-Cordero E, Guo H, Bartram S, Boland W (2014) In Vivo Pyro-SIP Оценка активной микробиоты кишечника хлопковой листовертки, Spodoptera littoralis .ПЛОС ОДИН 9(1): е85948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948

Редактор: Малкольм Джеймс Хорсбург, Ливерпульский университет, Соединенное Королевство

Получено: 3 октября 2013 г.; Принято: 4 декабря 2013 г.; Опубликовано: 27 января 2014 г.

Авторские права: © 2014 Shao et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания оригинального автора и источника.

Финансирование: Эта работа поддерживается Обществом Макса Планка. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Микробиота кишечника, в основном состоящая из бактерий, представляет собой сложную экосистему и формирует тесные симбиотические ассоциации с хозяином. Эти внутренние микробы не только процветают в кишечнике, но и способствуют метаболизму хозяина за счет высвобождения питательных веществ, детоксикации ксенобиотиков и иммунной регуляции, что значительно повышает приспособленность хозяина [1], [2].С быстрым развитием технологий секвенирования нового поколения растущее число исследований от людей до муравьев продемонстрировало захватывающее микробное разнообразие и состав в кишечнике [3], [4]. Однако на сегодняшний день оценка метаболически активных компонентов кишечной микробиоты на удивление скудна, особенно с точки зрения физиологии хозяина. Ясно, что не все микроорганизмы способны колонизировать кишечник, даже если он является богатой питательными веществами средой обитания, поскольку некоторые пищевые микробы лизируются, а некоторые переходные микроорганизмы остаются бездействующими во время прохождения кишечника [2].С другой стороны, активные популяции постоянно перемещаются в ответ на развитие хозяина и воздействие окружающей среды, и, следовательно, метаболические потенциалы, очерченные чисто метагеномным анализом, должны быть проверены in vivo [5]. Чтобы получить более полную картину, важно перейти от подхода, в основном основанного на секвенировании, к другим передовым инструментам для выявления активных фракций сообщества, которые непосредственно способствуют текущей функции микробиоты.

Зондирование стабильных изотопов (SIP) — перспективный, бескультуральный метод, который часто используется в микробиологии окружающей среды для выявления активных микроорганизмов, участвующих в различных биогеохимических процессах [6], [7]. Эта методология основана на ассимиляции источника углерода, меченного стабильным изотопом ( ¹³ C ), растущими микробами и селективном извлечении обогащенных изотопами клеточных компонентов, таких как наиболее информативные нуклеиновые кислоты, которые могут предоставить конкретную таксономическую информацию. ¹³ C-обогащенная «тяжелая» ДНК или РНК может быть отделена от немеченых, нормальных «легких» ( ¹² C) нуклеиновых кислот с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности и впоследствии извлечена из процедуры градиентного фракционирования для дальнейшего молекулярного анализа [8].Зондирование нуклеиновых кислот стабильными изотопами дает прямые доказательства метаболической активности бактерий и, как было показано, более чувствительно, чем подход, основанный на РНК [9]. Недавно Piloni et al. представил комбинацию DNA-SIP и пиросеквенирования, а именно Pyro-SIP, в интерпретации градиента SIP [10]. Однако в этом исследовании было проведено только пиросеквенирование всей метагеномной ДНК без градиентного разделения, и оно по-прежнему полагалось на фингерпринтинг на основе гель-электрофореза с низким разрешением (T-RFLP) и трудоемкое создание библиотеки клонов для идентификации активных бактерий. Учитывая все эти недостатки, здесь мы напрямую используем пиросеквенирование для изучения разделенных фракций градиента, чтобы получить большее разрешение, что является относительно простым и эффективно объединяет исследование структуры микробиоты с измерением локальной метаболической активности.

В качестве первой попытки мы успешно провели этот усовершенствованный Pyro-SIP, чтобы раскрыть метаболически активное бактериальное сообщество в кишечнике модельного организма насекомых, Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae), многоядного вредителя, обнаруженного во всем мире и вызывающего значительный урожай. потери многих хозяйственно важных культур.Разрушительная личиночная стадия S. littoralis (хлопковая листовертка) поглощает большое количество растительного материала за короткое время, высвобождая обильные сахариды растительного происхождения, в основном глюкозу, в пищеварительном канале, которые являются наиболее важным источником углерода и энергии как для хозяина, так и для активные кишечные бактерии. В последнее время все большее внимание уделяется микробиологии этого важного насекомого, в кишечнике личинок обнаружена сложная и изменчивая комменсальная микробиота [11], и предполагается, что кишечные бактерии участвуют в мультитрофических взаимодействиях между растением, травоядным и хищником, что ранее недооценены [12]–[14].

Используя ¹³ C глюкозу в качестве трофического звена, Pyro-SIP показал, что относительно простая, но отличительная кишечная микробиота развивается совместно с хозяином, причем как метаболическая активность, так и состав меняются на протяжении личиночных стадий. Три семейства, в том числе Enterococcaceae , Clostridiaceae и Enterobacteriaceae , особенно богаты и активны внутри, что, вероятно, представляет собой основные функциональные популяции в кишечнике, связанные с улучшением питания и защитой от патогенов для улучшения приспособленности личинок.Это исследование также представляет собой первую подробную инвентаризацию микробиоты кишечника модельного организма, состоящего в основном из чешуекрылых-фитофагов. Знание кишечных бактерий такого крупного травоядного насекомого может привести к новым целям для борьбы с вредителями.

Результаты

Идентификация и количественная оценка содержания сахаридов в кишечнике

Состав сахара был проанализирован в различных отделах кишечника, а именно в передней, средней и задней кишке. Содержимое кишечника, собранное у личинок, питавшихся их естественной пищей (хлопок) или определенной искусственной пищей (без антибиотиков или консервантов), анализировали с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) после водной экстракции и дериватизации ацетатом альдононитрила, что является быстрым и чувствительным методом. метод дериватизации нелетучих сахаридов, и каждый сахар образует один хроматографический пик после разделения ГХ [15], [16].

Профиль ГХ-МС показал, что в кишечнике присутствуют несколько сахаров пентозы и гексозы, включая рибозу, арабинозу, маннозу, глюкозу и галактозу (рис. 1А и В). Однако глюкоза преобладала во всех отделах кишечника, а другие мономеры находились в гораздо более низких концентрациях. Одинаковая картина состава сахарных мономеров в данной личиночной секции была обнаружена в каждой повторности. После кислотного гидролиза количество и концентрация обнаруживаемых моносахаридов увеличились, при этом преобладали глюкоза и арабиноза, что отражает наличие различных растворимых полисахаридов в кишечнике (рис.С1 и С2).

Рисунок 1. Сахарный состав содержимого кишечника хлопковой листовертки.

( A ) Сахара в содержимом кишечника личинок, питавшихся хлопком или ( B ) искусственной пищей по данным ГХ-МС после получения производных ацетата альдононитрила. Пищеварительный канал личинки делится на три отдела: переднюю, среднюю и заднюю кишку, показанные на схеме ( C ). ( D ) Количественное определение доминирующей глюкозы выявляет значительное снижение среднего содержания по ходу кишечника.Однако личинки, питающиеся хлопком, обнаруживают более высокое количество глюкозы во всех отделах кишечника. * и * и ^A Указывают на значительную разницу: P ( * ¹) = 0,0020, P ( * ²) = 0,0366, P (^A) = 0,0017. Столбики погрешностей указывают на стандартные ошибки. 1, рибоза; 2, арабиноза; 3, манноза; 4, глюкоза; 5, галактоза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g001

В качестве основного сахара глюкоза была определена количественно на основе специфического ферментативного анализа, который показал, что максимальные концентрации глюкозы возникают в передней кишке, а затем снижаются в передних отделах. к заднему концу кишки.У личинок, питающихся хлопком, средняя концентрация глюкозы в водной фазе передней кишки составляла примерно 17,7 мМ, что значительно выше, чем в задней кишке, которая составляла около 9,8 мМ (рис. 1D). Быстрое снижение уровня глюкозы от передней к задней кишке вдоль короткого пищеварительного канала указывает на то, что глюкоза заметно расходуется во время прохождения по кишечнику. Такая же тенденция была получена с личинками, которых кормили искусственным рационом. Однако средние значения концентрации глюкозы во всех отделах кишечника у личинок, питавшихся искусственным кормом, были ниже, чем у личинок, питавшихся хлопком (рис.1Д).

In Vivo Стратегия маркировки с помощью ¹³ C Глюкоза как трофическое звено

Как наиболее эффективный доступный источник энергии и углерода, пищевая глюкоза в кишечнике предоставила хороший шанс провести in vivo SIP путем внесения ¹³ C-глюкозной поправки. Начальные концентрации глюкозы в передней кишке личинок, питавшихся хлопком, достигали 20 мМ, но только около 10 мМ у личинок, питавшихся искусственным рационом (рис. 1D). Таким образом, искусственная диета была дополнена 10 мМ экзогенной глюкозы, чтобы имитировать концентрацию глюкозы in situ у личинок, питающихся хлопком.Чтобы отслеживать метаболически активные бактерии, в качестве обработки для мечения добавляли полностью ¹³ C-меченую глюкозу, тогда как такое же количество нативной глюкозы (¹² C) использовали в контрольной группе. Мы проверили процесс мечения, кормя личинок ранних возрастов (от 1 ^st до 2 ^nd) искусственными диетами с добавлением глюкозы в течение 24 и 48 часов соответственно. Для выявления различий в личиночном развитии тот же прием применяли и при изучении поздних личинок (5 ^th).

Личинки, взятые как из группы, получавшей ¹³ C, так и из немеченой контрольной группы, вскрывали в каждый момент времени, и из свежих тканей кишечника выделяли тотальную ДНК. Масс-спектрометрия изотопных отношений (IRMS) измерения δ ¹³ C в выделенной ДНК показали значительное изотопное обогащение как через 24 часа (δ ¹³ C = 33,6 ± 5,3 ‰), так и через 48 часов (δ ¹³ C = 141,2 ± 33,1‰) мечение образцов по сравнению с естественным содержанием стабильных изотопов в контроле (δ ¹³ C = −30.7±1,3‰) (рис. 2Б). Кормление в течение 48 ч усилило процесс мечения с изотопным сдвигом, превышающим 100‰ (P = 0,0008), что указывает на то, что обильные вновь делящиеся бактериальные клетки уже заменили старые. Учитывая, что большое количество ДНК насекомых было соэкстрагировано из ткани кишечника, реальная доля ¹³ С в чистой бактериальной ДНК будет еще выше, что подходит для центрифугирования в градиенте плотности для выделения меченых нуклеиновых кислот и выявления активного сообщества. члены.

Рис. 2.Профилирование активных бактерий.

( A ) Для определения активных бактерий ¹³ C-меченая ДНК отделяется ультрацентрифугированием в градиенте плотности и затем извлекается из репрезентативных фракций, более темный цвет указывает на меченую тяжелую ДНК. Все выделенные образцы ДНК (легкие, средние и тяжелые) были непосредственно подвергнуты количественному пиросеквенированию для выявления видового происхождения и относительной численности. Для каждого таксона X метаболическую активность рассчитывают как разницу в относительной численности между тяжелой фракцией меченого образца и контрольной.( B ) Изотопное соотношение (δ ¹³ C) образцов ДНК. ( C ) Распределение содержания ДНК в градиентных фракциях при лечении глюкозой. Обозначения: O , ДНК, экстрагированная из [¹² C]-контроля глюкозы; ▪ ДНК, экстрагированная после обработки [¹³ C]-глюкозой в течение 24 часов; ▴ , ДНК, экстрагированная после обработки [¹³ C]-глюкозой в течение 48 часов. Стрелки указывают, что значительные ¹³ C-меченых ДНК смещаются в сторону больших градиентов по сравнению с контролем.( D ) Анализ градиентной фракции по плотности после 40 ч центрифугирования 1,725 г мл ^-1 исходного раствора CsCl. Столбики погрешностей указывают на стандартные ошибки.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g002

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности и восстановление отделенной ДНК

И меченые, и контрольные образцы были подвергнуты одной и той же серии изопикнического ультрацентрифугирования, чтобы свести к минимуму возможные отклонения в ходе этого процесса. После 40-часового ультрацентрифугирования образовавшиеся градиенты фракционировали на 12 равных аликвот и количественно определяли содержание ДНК, присутствующей в каждой отдельной фракции, что позволило нам сравнить распределение матрицы ДНК в сформированных градиентах (рис. 2А). Плотность всех фракций из контрольной и меченой проб проверяли взвешиванием, охватывая средний градиент от 1,688 г мл ^-1 до 1,761 г мл ^-1 , что находилось в ожидаемом диапазоне согласно предыдущим отчетам [8]. .Определение плотности выявило линейный тренд снизу вверх, что указывает на правильное формирование градиента (рис. 2D).

После 24-часового кормления меченая ДНК из метаболически активных бактерий была измерена при обработке ¹³ C, которая имела новый пик обильной ДНК при плавучей плотности (BD) 1,730 г мл ^-1 (фракция 5). Через 48 ч пик сместился в сторону еще более тяжелой фракции при БД 1,735 г/мл ^-1 (фракция 4), что свидетельствует о большем включении ¹³ С в ДНК, что подтверждает данные IRMS. Напротив, большая часть ДНК из немеченого контроля по-прежнему распределялась по легким фракциям (BD составляла <1,718 г/мл ^-1 ), и ни один пик не смещался в сторону высокого BD (рис. 2C). Примечательно, что во всех фракциях градиента был обнаружен низкий фон неспецифических нуклеиновых кислот, что характерно для эксперимента SIP в окружающей среде [17]. Поскольку образец с 48-часовым питанием давал значительно более высокий уровень обогащения, а больший сдвиг в BD обеспечивал эффективное отделение ДНК, меченной изотопами, от немеченой ДНК, образцы после этой обработки были отобраны для последующей молекулярной характеристики микробного сообщества.

гена 16S рРНК амплифицировали с общим бактериальным праймером из каждой градиентной фракции. Амплификация контрольных градиентов дала очевидные продукты ПЦР из фракций с 8 по 12, что соответствует мазку ДНК, полученному после ультрацентрифугирования, и несколько слабых полос в тяжелых фракциях, которые ожидались от неспецифической фоновой ДНК. Напротив, меченый образец показал повышенную интенсивность полос в соответствующих тяжелых фракциях (3–6), что было вызвано повышенным количеством матрицы ¹³ C-ДНК.Затем ампликоны 16S рДНК, обнаруженные в градиентных фракциях, анализировали с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) для идентификации сообщества. Изменения стали видны, когда профиль DGGE, полученный при обработке ¹³ C, сравнили с профилем немеченого контроля. Несколько сильных полос были четко обнаружены в тяжелых фракциях (3–6) меченого образца, тогда как картина почти не изменилась во всех градиентах контроля (рис. S3). Эти уникальные закономерности, связанные с тяжелыми фракциями в образце с измененным стабильным изотопом, но не в нативном контроле с измененным субстратом, предоставили убедительные доказательства связи определенных организмов с метаболической активностью кишечника in situ .В совокупности данные подтвердили успешное включение ¹³ C в ДНК активных кишечных бактерий.

На основании дактилоскопического анализа мы объединили фракции с БД от 1,730 до 1,735 г/мл ^-1 в составную «тяжелую» фракцию. BD составляли около 1,718 г мл ^-1 в «средней» фракции и от 1,688 до 1,705 г мл ^-1 в «легкой» фракции для последующего пиросеквенирования.

Общая микробная структура в кишечной флоре и филогенетический анализ

Количественное пиросеквенирование было выполнено непосредственно на репрезентативных градиентах SIP, чтобы выявить родословную видов и относительную численность.ПЦР-амплификация с использованием специфичных для архей или грибов праймеров не привела к амплификации каких-либо последовательностей 16S рРНК архей или ITS грибов. Попытки на основе культивирования восстановить грибы из кишечника с помощью трех обычных чашек с агаром для выращивания грибов также не увенчались успехом (рис. S4).

Специфический для бактерий праймер для пиросеквенирования амплифицирует область V1–V3 гена 16S рРНК для таксономической классификации. После шумоподавления и удаления химерных последовательностей было сгенерировано 120 045 прочтений высокого качества со средней длиной 404 нуклеотида.Частота последовательностей, неклассифицированных на уровне типа, была низкой (максимум 3,82%). Для всех образцов кривая разрежения имела тенденцию к насыщению при одинаковом количестве последовательностей на уровне видов, что указывает на то, что выборка была полной (рис. 3А и 4А). Для точной оценки разнообразия отдельных образцов использовались различные методы (табл. 1). Микробиота кишечника хлопковой листовертки была таксономически ограничена и содержала 22–42 операционные таксономические единицы (OTU), обнаруженные при сходстве последовательностей 97%, при этом Proteobacteria и Firmicutes были кодоминантными типами.Индекс разнообразия Шеннона 1,46–2,48 был нижней границей разнообразия почв (2,4–3,6) [18].

Рисунок 3. Бактериальное разнообразие и относительная численность микробиоты кишечника личинок раннего возраста.

( A ) Кривые разрежения последовательностей 16S рДНК были получены из репрезентативных фракций SIP контроля ([¹² C]) и обработки мечением ([¹³ C]). ( B ) Относительное обилие бактериальных таксонов в различных фракциях SIP, представленное на графике относительной площади, полученное с помощью пиросеквенирования.Сокращения: [¹² C] Легкие, легкие фракции (фракции 9–11, рис. 2А) нативной глюкозной добавки; [ ¹² C] Средняя, средняя фракция (фракция 7) того; [ ¹² C] Тяжелые, тяжелые фракции (фракции 4–5) тех; [ ¹³ C] Легкие, легкие фракции ¹³ С-глюкозная добавка; [ ¹³ C] Средняя, средняя часть этого; [ ¹³ C] Тяжелые, тяжелые фракции того.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g003

Рисунок 4. Бактериальное разнообразие и относительная численность в микробиоте кишечника личинок поздних возрастов.

( A ) Кривые разрежения последовательностей 16S рДНК были получены из репрезентативных фракций SIP личинок ранних и поздних возрастов. Сокращения: E, репрезентативные фракции личинок раннего возраста, питавшихся ¹³ C-глюкозой; L, фракции личинок поздних возрастов, питавшихся ¹³ С-глюкозой. ( B ) Относительное обилие бактериальных таксонов в различных фракциях SIP, представленное на графике относительной площади, полученное с помощью пиросеквенирования.Сокращения те же, что и на рис. 3.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g004

«Легкая» фракция, собранная из немеченых контролей, в которых все еще распределялась большая часть метагеномной ДНК, служила для профилирования большей части бактериального сообщества. Из-за меньшего количества матриц ДНК из доминантных групп, транслоцированных в тяжелую фракцию контроля, некоторые менее распространенные бактерии, такие как Comamonas и Stella , имели больше шансов на амплификацию и показали повышенную долю в профиле ¹² C]-тяжелая фракция (рис.3Б). Таким образом, всесторонний анализ всех фракций из немеченого контроля SIP предоставил подробную информацию об общем разнообразии сообщества, которое в значительной степени аналогично разнообразию личинок, питавшихся диетой из белой фасоли без ультрацентрифугирования ДНК (рис. S6). Явно сниженная численность доминантных групп, таких как Pantoea и Citrobacter , в средней и тяжелой фракциях, вызванная меньшим количеством последовательностей-мишеней, также отражала некоторые количественные свойства пиросеквенирования [19].Всего с помощью классификатора RDP из набора данных было идентифицировано одиннадцать типов, но только пять из них показали относительную численность более 0,1% по крайней мере в одной из проанализированных проб (таблица 2). Фирмикуты, по-видимому, доминировали на обеих личиночных стадиях развития, что составляло 59,2% от числа последовательностей личинок ранних и 97,2% поздних стадий.

Proteobacteria был еще одним основным типом личинок раннего возраста, на долю которого приходилось 38,9% от общего числа последовательностей. Бактерии этого типа особенно широко распространены в микробиоте травоядных и часто связаны с симбионтами насекомых.Наиболее доминирующие OTU соответствовали Pantoea citrea и Citrobacter farmeri , которые составляли 17,2% и 16,4% прочтений соответственно и принадлежали к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria ([¹² C] светлый, рис. 3Б). В дополнение к Enterobacteriaceae , другие гаммаплотебактерии из семейства ксинтомонадацеаэа , Pseudomonadaceae и PseudomonAdaceae и 3б и 5б). Также были идентифицированы другие классы протеобактерий, такие как Paracoccus из Alphaproteobacteria и Geobacter из Deltaproteobacteria. Организмы из филума Actinobacteria, включая роды Micrococcus , Solirubrobacter и Propionibacterium , а также новую группу GP2 из филума Acidobacteria, составляли небольшую часть прочтений. Однако эти редкие филотипы способствовали богатству сообщества.

Рисунок 5. Филогенетический анализ (а) Firmicutes и (b) Proteobacteria, идентифицированных из кишечной микробиоты хлопковой листовертки.

( A ) Дерево максимального правдоподобия было получено из данных о частичной последовательности 16S рДНК для членов Firmicutes. ( B ) Дерево Neighbor-Joining было получено из данных о частичной последовательности 16S рДНК для членов Proteobacteria. Репрезентативные пиросеквенции из этой работы и почти полноразмерные последовательности 16S рДНК, извлеченные из предыдущих исследований на основе библиотеки клонов, обозначены черными кружками (•) и синими кружками соответственно.Помеченные таксоны отмечены треугольниками (▴). Эталонные последовательности загружаются из GenBank (номер доступа указан в скобках). Methanosarcina barkeri (AF028692) используется в качестве внешней группы. Кластеры семейного уровня обозначены разными цветами. Значения начальной загрузки (в процентах) основаны на 1000 повторений. Столбик представляет расхождение последовательности 2%. Правый раздел обозначает процент репрезентативных последовательностей бактериальной 16S рРНК в общем наборе данных каждого образца. Сокращения: + ¹² C, поправка на нативную глюкозу; + ¹³ C, ¹³ C-глюкозная добавка; L, легкие фракции; Н, тяжелые фракции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g005

Firmicutes были представлены семейством Enterococceae , составляющим >50% всех последовательностей. Основная OTU была тесно связана с Enterococcus mundtii , как определено с помощью Mega BLAST с репрезентативной последовательностью. Другие вида Enterococcus с низкой оценкой идентификации, такие как E. casseliflavus , также были обнаружены, но они составляли лишь небольшую часть.Небольшое количество 90 003 Clostridia 90 004 также было извлечено из личинок раннего возраста.

Микробиота кишечника претерпела резкое изменение на поздних стадиях развития, в основном характеризующееся снижением видового богатства и разнообразия (таблица 1). Кривая разрежения была значительно ниже, чем у личинок раннего возраста (рис. 4А). Фирмикуты абсолютно доминировали во всем сообществе, составляя> 97% всех прочтений; одновременно уменьшались последовательности из других типов ([ ¹² C]-свет, рис.4Б). Чтения пиросеквенирования, принадлежащие к видам Clostridium , сильно увеличились: 21% от общего числа последовательностей были связаны с видами Clostridium . Enterococcus по-прежнему преобладал, составляя 75% прочтений. Также были обнаружены другие бактерии Firmicutes, такие как представители родов Lactobacillus , Lactococcus , Anoxybacillus и Staphylococcus (рис. 5А).

Однако, что касается протеобактерий, личинки поздних возрастов в основном снижали долю гаммапротеобактерий. Pantoea был обнаружен в небольшом количестве, всего 1,8% от общего числа последовательностей ([ ¹² C]-свет, рис. 4B). Citrobacter быстро уменьшались вместе. В дополнение к обычным Paracoccus было обнаружено больше Alphaproteobacteria, таких как представители родов Sphingomonas , Caulobacter и Rhizobium . Но при этом были удалены Stella и Methylobacterium . Бетапротеобактерии исчезли из личинок поздних возрастов, за исключением Vogesella .Другие филогенетические группы, относящиеся к родам Prevotella (Bacteroidetes), Micrococcus и Propionibacterium (Actinobacteria), появились в небольшом количестве последовательностей.

Филогенетический анализ показал, что некоторые прочтения пиросеквенирования сгруппированы вместе с последовательностями 16S почти полной длины, извлеченными из других исследований на основе библиотеки клонов, что предполагает наличие общих таксонов, присутствующих в S. littoralis (рис. 5). Примечательно, что состав микробиоты кишечника у личинок, питавшихся этой искусственной диетой с добавлением физиологической дозы сахара, был аналогичен составу микробиоты, питавшейся ее естественной растительной диетой [11].В результате нашего крупномасштабного пиросеквенирования было обнаружено множество малочисленных таксонов, которые более точно представляли общее микробное сообщество, а также обеспечивали достаточное таксономическое разрешение.

Характеристика метаболически активных бактерий в сообществе

«Тяжелые» фракции, собранные из меченого образца, содержащего значительные количества ¹³ C-обогащенной ДНК, и фракции, собранные из немеченого контроля, служили для профилирования активных популяций в сообществе. На основании предыдущих исследований метаболическую активность бактерий оценивали, вычисляя разницу между относительной численностью отдельных таксонов в тяжелой фракции меченого образца и контроля (рис. 2А) [20], [21]. Кроме того, включение надлежащего контроля в анализ SIP вычло влияние фонового загрязнения ¹² C-ДНК в тяжелой фракции, что гарантировало, что появление или исчезновение бактериального разнообразия и численности не было артефактами самого метода.Кривая разрежения образца «тяжелой» фракции была ниже, чем у «легкой» фракции, поскольку группа активных бактерий была подмножеством всего сообщества (рис. 3А).

На ранних стадиях пиросеквенирование тяжелой фракции меченого образца ([ ¹³ C]-Heavy, рис. 3B) показало значительное увеличение численности определенных видов, включая Pantoea , Citrobacter и Clostridium с помощью анализа METASTATS (P<0,05), в то время как незначительные части этих последовательностей были обнаружены в тяжелой фракции контроля ([ ¹² C]-Heavy, рис. 3Б). Поэтому ДНК этих бактерий была значительно помечена, и они считались метаболически активными. Самая высокая активность была оценена для Pantoea и Citrobacter с коэффициентом стимуляции выше 10% (рис. 6). Разнообразный набор других протеобактерий из родов Acinetobacter , Stenotrophomonas , Delftia , Achromobacter и Vogesella также показал некоторую активность в соответствии с их слегка повышенной интенсивностью в тяжелой фракции. Clostridium была другой группой, которая показала высокую метаболическую активность, хотя на этой стадии ее было меньше. Близкородственные филотипы этих активных видов обычно обнаруживаются в кишечнике травоядных и являются хорошо известными разрушителями биомассы растений. Enterococcus в изобилии присутствовал во всех фракциях SIP независимо от состояния, но количество последовательностей достигало максимума в средней фракции меченого образца по сравнению с контрольным образцом, что указывает на то, что он был метаболически менее активен, ДНК из которого была меньше включена с ¹³ С и не мог полностью перейти в тяжелую фракцию. Представители таких родов, как Paracoccus , Solirubrobacter и Propionibacterium , не были ни обогащены, ни обнаружены во фракции C-ДНК ¹³, и поэтому считались метаболически неактивными бактериями.

Рисунок 6. Частота последовательностей 16S рРНК в микробиоте, полученная при контроле нативной глюкозы (относительная численность бактерий) и обработке [ ¹³ C]-глюкозой (метаболическая активность бактерий), представленная в виде тепловой карты.

На левой панели показаны динамические изменения таксонов личинок раннего возраста, а на правой панели — позднего возраста.Теплые цвета указывают на более высокую, а холодные цвета на более низкую численность, рассчитанную по формуле на рис. 2А (также см. рис. 5 для процентного соотношения таксонов).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085948.g006

В позднем возрасте Enterococcus был более обильным в тяжелой фракции меченого образца, чем в контроле, будучи наиболее активным членом внутри сообщества. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) выявила большое количество энтерококков , тесно прилипших к слизистому слою кишечного эпителия, где они образовали толстую структуру, подобную биопленке (рис.S5а и б). Интересно, что изолята Enterococcus могут продуцировать новые противомикробные соединения против других бактерий (рис. S5c и d). Clostridium sp. оставался на высоком уровне популяции, что было следствием его высокой активности в раннем возрасте; однако на этой стадии метаболическая активность была незначительной или отсутствовала. Pantoea и другая Proteobacteria, Vogesella , были активно персистентны на обеих стадиях развития. Напротив, Citrobacter не были обнаружены.Но особую активность проявлял род Legionella . Bacteroidetes, в том числе Prevotella и Hymenobacter , проявляли некоторую метаболическую активность. Другие популяции были обнаружены как активные, в том числе Tetrasphaera , Microbacterium и Corynebacterium , связанные с типом Actinobacteria, и Anoxybacillus Firmicutes.

В совокупности in situ SIP обозначали различные модели метаболической активности, обнаруживаемые в кишечной микробиоте во время развития личинок.Консорциум Enterobacteriaceae (особенно Pantoea , Citrobacter ) и Clostridium , по-видимому, был более активен в личинках раннего возраста, в то время как Enterococcus проявлял высокую активность в полностью выращенных личинках позднего возраста (рис. 6). Эти изменения могут быть напрямую связаны с их функциональной ролью в кишечнике.

Обсуждение

Хотя SIP часто используется в микробиологии окружающей среды, очень немногие исследования применяли этот ценный метод для изучения микробиоты кишечника.Эти новаторские исследования были почти исключительно посвящены экспериментальным системам in vitro для имитации среды кишечника, что, очевидно, не могло полностью воспроизвести истинные физиологические условия в интактном кишечнике, особенно факторы хозяина, формирующие микробное сообщество, и, следовательно, могут быть ограниченными или предвзятыми [5]. ], [20].

Напротив, мы непосредственно изучили микробиоту кишечника хлопковой листовертки in vivo , сочетая методы пиросеквенирования и SIP. Хлопковые листовертки обладают простым трубчатым пищеварительным трактом, который является самой большой частью всего тела и не имеет каких-либо специализированных подструктур (рис.1С). Несмотря на свою простоту, было обнаружено большое количество бактерий, превышающее 10 ⁷ мл ^-1 [22], населяющих кишечник, и там высвобождается высокая концентрация пищевой глюкозы, что делает кишечник идеальной средой для разнообразных микробов. деятельность, в том числе ферментативную. Эти свойства делают этот организм идеальной природной моделью для изучения микробного симбиоза пищеварительного тракта. Как эффективный и вездесущий источник энергии и углерода, глюкоза обеспечивает полезную трофическую связь для выявления метаболически активных кишечных бактерий путем отслеживания их ассимиляции измененной ¹³ C-глюкозы в искусственной диете. Кишечник содержит другие немеченые источники углерода, такие как аминокислоты, которые могут быть использованы микробами. Однако эти метаболически активные бактерии должны одновременно потреблять доминирующую обычную глюкозу и, таким образом, маркируются. Концентрация глюкозы, близкая к in situ , и относительно короткое время мечения гарантировали, что подход SIP не повлияет на первоначальное кишечное сообщество, как подробно описано в другом месте [20]. Перекрестное питание обычно является основным ограничением при интерпретации экспериментов SIP, что не является проблемой в настоящем исследовании, поскольку мы стремились захватить все активное сообщество, а активные бактерии, скорее всего, вовлечены в трофическую сеть in situ [23].ДНК, полученная в результате обработки ¹³ C-глюкозой, стала обогащенной ¹³ C на основе заметного сдвига ДНК в сторону более высоких значений BD; в противоположность этому, никакого сдвига не наблюдалось в случае контролей с измененной нативной глюкозой. Существенная маркировка ДНК также была подтверждена дополнительными методами, включая измерение изотопного соотношения масс-спектрометрией и анализ отпечатков пальцев. In vivo SIP предоставляет ключевую информацию о том, какие группы в настоящее время участвуют в метаболизме кишечника, и эти активные ассоциаты бактерий потенциально способствуют приспособленности хозяина.Большая глубина выборки пиросеквенирования гарантировала эффективное исследование разнообразия, а анализ разрежения показал, что наш набор данных обеспечивает достаточную степень охвата для всех выборок.

Комплексный анализ восстановленной ДНК выявил относительно простую, но своеобразную микробиоту кишечника, которая развивается совместно с хозяином; как состав, так и метаболическая активность устойчиво меняются на личиночных стадиях. В целом, при пиросеквенировании преобладали таксоны Proteobacteria и Firmicutes.Аналогичная картина недавно была описана у личинок плодовой мухи [24]. Примечательно, что бактерии из этих типов широко распространены в кишечнике муравьев-черепах, пчел, мотыльков и бабочек, что позволяет предположить, что они могут представлять собой основные типы в микробиоте кишечника травоядных насекомых [25]–[27]. Простота этого сообщества, состоящего из 22–42 OTU, особенно очевидна по сравнению с кишечной микробиотой насекомых из таких отрядов, как термиты Isoptera, или позвоночных, которые часто содержат сотни филотипов [28], [29].Сильная щелочность в кишечнике, считающаяся важным фактором, определяющим структуру сообщества личинок жуков, также может иметь место у Spodoptera , у которых pH средней кишки > 10 [22], [30]. Другие ключевые факторы, в том числе пропускная способность фаст-фуда и функция иммунной системы, также могут быть причиной этой таксономически ограниченной кишечной флоры [31]. Однако три семейства, в том числе Enterococcaceae , Clostridiaceae и Enterobacteriaceae , особенно богаты и активны, и они, вероятно, являются основными функциональными популяциями, живущими внутри кишечника.Кроме того, обнаруживаются явные изменения в развитии (ранний возраст по сравнению с поздним возрастом). Мало того, что они постоянно встречаются на протяжении всей жизни личинок, эти бактерии также постоянно идентифицируются в различных партиях образцов нормальных личинок, что указывает на то, что они являются коренными жителями кишечника и могут быть истинными симбионтами S. littoralis .

На ранних стадиях наиболее активной группой была разнообразная группа протеобактерий, особенно гаммапротеобактерий, в которой доминировали Pantoea и Citrobacter из семейства Enterobacteriaceae .Бактерии этого типа тесно связаны с травоядными насекомыми и обладают широкими способностями к деградации полисахаридов [32]–[34]. Например, исследования, основанные на культивировании, показали, что Enterobacteriaceae , выделенные из кишечника тутового шелкопряда ( Bombyx mori ), обладали способностью секретировать ферменты, важные для переваривания сложных пищевых биополимеров растений, таких как целлюлоза, ксилан и пектин [32]. Геномный анализ штамма Pantoea древолаза ( Sirex noctilio ) выявил гены, предположительно кодирующие ферменты, активные в отношении углеводов, причем большинство из них, по прогнозам, активны в отношении гемицеллюлозы и более простых сахаров [33].Эти анализы роста in vitro и геномные исследования дают начальную картину потенциальных метаболических способностей, но не дают информации о бактериальной активности in situ . Наши результаты Pyro-SIP являются прямым свидетельством микробной метаболической активности in vivo , подтверждая предыдущую гипотезу о том, что симбионты гаммапротеобактерий участвуют в деградации углеводов. Несмотря на низкий титр, Clostridium была еще одной высокоактивной группой у личинок ранних возрастов; эти облигатные анаэробы способны образовывать эндоспоры.Колонизация Clostridia обычно связана с ее высокоэффективным перевариванием целлюлозы и ее способностью ферментировать различные сахара [35]. Можно предположить, что аналогичную роль играют бактерии, ассоциированные с хлопковой листоверткой. Кроме того, Clostridia могут повышать иммунитет хозяина [36]. В совокупности мы предполагаем, что наиболее активные Enterobacteriaceae и Clostridiaceae синергически участвуют в пищеварительном процессе в кишечнике, способствуя расщеплению органических субстратов в листве и делая их более подходящими для пищеварения, всасывания и метаболизма хозяина. Учитывая, что достаточное снабжение питательными веществами важно в раннем возрасте, высвобождаемые простые сахара будут непосредственно способствовать раннему развитию личинок, которые в дальнейшем могут ферментироваться в различные другие питательные вещества, такие как жирные кислоты с короткой цепью, что значительно улучшает экологическую среду кишечника. Эти бактерии, широко распространенные в природе, могут быть легко приобретены при кормлении личинок. Большая глубина выборки этого исследования выявила ряд редких таксонов в кишечнике. Хотя это разнообразие со временем уменьшилось, возможно, что редкие представители выполняют некоторые функции микробиоты или играют роль в особых ситуациях, как предполагалось в предыдущих исследованиях [37].Необходима дальнейшая работа, чтобы расшифровать их потенциальные биологические функции в кишечнике.

В позднем возрасте кишечная микробиота стала еще проще со значительным уменьшением микробного разнообразия и богатства. Более 97% членов сообщества принадлежали к Firmicutes, частично из-за значительного распространения Clostridium . Enterococcus преобладал и определялся как наиболее активная группа. Успешная экспансия Firmicutes с течением времени, вероятно, в свою очередь подавляла рост бактерий из других типов в той же среде обитания, особенно Proteobacteria.Связанные с развитием личинок изменения в физиологии насекомых, такие как снижение окислительно-восстановительного потенциала и усиленный иммунологический ответ хозяина, могут быть потенциальными движущими факторами наблюдаемых изменений. По мере того, как личинки становятся больше, меньше кислорода может проникать в просвет кишечника через более толстую стенку кишечника и удлиненный пищеварительный тракт, что вызывает постоянно низкое напряжение кислорода в отделе кишечника [11]. Это преимущественно аноксическое состояние, вероятно, способствует развитию облигатных анаэробов Clostridium и факультативных анаэробов Enterococcus .

Enterococcus , грамположительная молочнокислая бактерия (LAB), является единственным преобладающим родом в сообществе. МКБ являются хорошо известными полезными организмами кишечной микробиоты многих животных, включая насекомых [38]. Enterococci практически стабильны на протяжении всей жизни Spodoptera и вертикально передаются от матери к потомству через яйцо, как показано для Manduca [9]. Поэтому они первыми получают доступ к кишечнику и сразу после вылупления могут доминировать там.Как вид-основатель, Enterococcus , вероятно, контролирует всю микробиоту вместе с хозяином, что может иметь решающее значение для создания характерного и повторяющегося кишечного сообщества. Помимо хлопковой листовертки, Enterococcus присутствует в различных чешуекрылых, таких как личинки непарного шелкопряда ( Lymantria dispar ) и хлопковой совки ( Helicoverpa armigera ) как из полевых, так и из лабораторных образцов [39], [40]. ]. Примечательно, что Enterococcus уже был активен в отношении яиц табачной аскариды ( Manduca sexta ) на основе обнаружения рРНК [9]. Эти тесные связи указывают на то, что Enterococcus может иметь важные функциональные последствия для чешуекрылых в целом. FISH показал, что большое количество энтерококков тесно прикрепляются к слизистому слою кишечного эпителия, образуя структуру, подобную биопленке, что может быть причиной его высокой стабильности в кишечнике здоровых личинок и, кроме того, может предотвращать кишечную непроходимость. от заражения вредоносными патогенными микробами [34], [41]. Помимо обеспечения физического барьера, изолированные штаммы продемонстрировали сильное ингибирование против других бактерий.Новый противомикробный пептид был идентифицирован из бульонной культуры (Shao, неопубликованные данные). В совокупности эти результаты показывают, что Enterococcus , вероятно, является защитным симбионтом для здоровья хозяина. Учитывая, что хлопковая листовертка является универсальным кормильцем в полевых условиях, ее пищеварительный тракт постоянно подвергается воздействию потенциально вредных бактерий и грибковых эндофитов, которые она проглатывает. Энтерококки , поддерживаемые в биопленкоподобной структуре и демонстрирующие мощные противомикробные свойства, могут быть в состоянии установить эффект резистентности к колонизации в кишечнике, который защищает хозяина от патогенов и широкого спектра некомменсальных конкурирующих микробов извне [2], [ 42].Однако хорошо зарекомендовавшие себя энтерококки не нуждаются в полном включении своего метаболического механизма в полустерильной лабораторной среде выращивания, что может объяснить их низкую метаболическую активность на ранних этапах развития. Мало того, что они связаны с улучшением питания и защитой от патогенов, активные бактерии могут также способствовать другому метаболизму кишечника, например, детоксикации вредных аллелохимических веществ растительного происхождения и регулированию иммунного гомеостаза хозяина. Метагеномный анализ меченой ДНК из этого исследования расширит наши знания о других функциях, выполняемых активной микробиотой.

В ходе совместной эволюции аборигенные кишечные бактерии приспособились к совместной работе в этой особой экологической нише и обеспечивают свои метаболические преимущества хозяину. С другой стороны, различные физико-химические условия развития хозяина, такие как щелочность кишечника, напряжение кислорода, могут влиять на активность сообщества, что, в свою очередь, влияет на его состав и, следовательно, на метаболические функции. Таким образом, и хозяин, и настоящие симбионты тщательно регулируют свою собственную метаболическую активность и эффективность, чтобы сохранить мутуализм между хозяином и микробами. Измерение активности in vivo , предлагаемое SIP, помогает лучше понять изменения и поддержание микробного сообщества и дает более глубокое представление о роли активных членов в приспособленности хозяина. Наши данные также позволили провести первую углубленную инвентаризацию кишечной микробиоты модельного организма, состоящего в основном из растительноядных чешуекрылых. Знание кишечных бактерий у такого крупного травоядного насекомого может также предоставить новые цели для борьбы с сельскохозяйственными вредителями.

Это пилотное исследование показывает, что Pyro-SIP может быстро получить представление не только о структуре сообщества, но, что более важно, о локальной метаболической активности его компонентов с высоким разрешением и высокой точностью, что обеспечивает отправную точку для исследования более сложных экосистем. таких как термиты или человеческая микробиота.Хотя наша работа была сосредоточена на различении общих активных кишечных бактерий путем отслеживания вездесущей глюкозы, аналогичный анализ может быть выполнен для более конкретных источников углерода, например, путем маркировки защитных соединений растений для оценки активных бактерий, участвующих в процессе детоксикации хозяина. Таким образом, Pyro-SIP также предоставляет еще один способ понять сложный метаболизм кишечника, разбив его на части. С развитием таких новых подходов вскоре может произойти революция в понимании внутреннего мира жизни.

Материалы и методы

Выращивание насекомых и растений и сбор образцов

Spodoptera littoralis (яйца, приобретенные у Bayer Cropscience, Monheim, Germany) были выведены и выращены на стерильной искусственной диете, состоящей из белой фасоли и необходимых питательных веществ без добавления антибиотиков или консервантов. Все растения хлопчатника ( Gossypium hirsutum DP90) выращивали в нашей теплице в стандартных условиях (23±2°С, влажность 50±5%, световой день 16 ч). Для анализа состава сахаров в кишечнике личинок выращивали на рассаде хлопчатника в горшках или на свежем искусственном корме в ящиках соответственно. Через 7 дней после кормления личинок промывали, помещали на лед и препарировали для сбора содержимого кишечника под препаровальным микроскопом. Пищеварительный канал был разделен на три области (передняя, средняя и задняя кишка) стерильными ножницами (рис. 1C), и содержимое кишечника из каждой секции было выпущено в пробирки Эппендорфа. Материал из одного и того же участка из пяти-восьми образцов объединяли, чтобы получить приблизительно 0.6 г на образец для экстракции сахара. Для анализа активных кишечных бактерий было проведено зондирование стабильных изотопов на личинках раннего возраста (от 1 ^st до 2 ^nd) или личинках позднего возраста (5 ^th) в течение 24 и 48 часов с использованием искусственной диеты с добавлением глюкозы. . Искусственную диету часто меняли, чтобы избежать заражения. Целые кишки личинок собирали, как указано выше, для выделения ДНК. Для каждого анализа эксперимент проводили в трехкратной повторности.

Анализ состава сахара

Для характеристики растворимых органических соединений в пищеварительном тракте свежесобранное содержимое кишечника экстрагировали в соответствии с опубликованными литературными данными [20], [43].Вкратце, образцы экстрагировали 2 мл бидистиллированной воды в термомиксере (Comfort, Eppendorf, Гамбург, Германия) при 60°C, 1400 об/мин в течение примерно 2 минут, затем охлаждали на льду и гомогенизировали с помощью ротационного миксера (RM- Multi 1, STARLAB, Гамбург, Германия) в течение 6 ч при 4°С. Надосадочные жидкости (экстракты) отделяли центрифугированием (22000×g, 5 мин при 4°C) и фильтровали (размер пор 0,22 мкм) для анализа растворимых сахарных соединений. Поскольку сахариды нелетучи, затем перед анализом ГХ-МС проводили стадию дериватизации экстракта, как описано ранее [16].После реакции дериватизации 1 мкл супернатанта подвергали анализу GC-EIMS (Finnigan Trace GC-MS 2000, ThermoQuest, Эгельсбах, Германия). Колонку Phenomenex ZB-5 (15 м × 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм) использовали для разделения производных сахаров. В качестве газа-носителя использовали гелий при расходе 1,5 мл мин ^-1 . Температурную программу задавали следующим образом: 80°С (2 мин), затем при 15°С мин ^-1 до 300°С (6 мин). Данные были получены и обработаны с использованием программного обеспечения Xcalibur (Thermo Scientific, Саннивейл, Калифорния, США).Масс-спектры снимали в режиме мониторинга выбранных ионов (SIM) при 70 эВ. Все соединения были идентифицированы путем сравнения их времени удерживания и данных МС с подлинными эталонами. Аликвоту экстракта также гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой (TFA; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) при 100°C в течение 2 ч, солюбилизируя матричные полисахариды в их моносахариды, а затем дериватизировали в соответствующие альдононитрилы. ацетаты. Дальнейший анализ ГХ-МС был идентичен анализу негидролизованных экстрактов.Концентрацию глюкозы проверяли с помощью набора для анализа глюкозы на основе специфического и чувствительного ферментативного метода в соответствии с протоколом, предоставленным производителем (GAHK-20, Sigma-Aldrich).

Экстракция ДНК и амплификация

Все свежесобранные образцы кишечника сушили при 45°C в Speedvac (концентратор 5301, Eppendorf) и измельчали в пробирке Eppendorf на 1,5 мл стерильным пластиковым пестиком. Геномную ДНК экстрагировали с использованием набора для выделения ДНК PowerSoil™ (MO BIO Laboratories, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с протоколом производителя.Дополнительный этап нагревания при 65°С в течение 10 мин был включен непосредственно перед бисерным биением. После очистки концентрации ДНК определяли количественно с помощью спектрофотометра NanoVue (GE Healthcare Europe GmbH, Фрайбург, Германия). Успешная экстракция микробной метагеномной ДНК из кишечника была подтверждена с помощью ПЦР с обычными бактериальными праймерами 16S рРНК (27f и 1492r) [30]. Реакция ПЦР была описана ранее [11]. Праймеры, специфичные для архей и грибов, использовали для амплификации генов ITS архей 16S или грибов (таблица S1) [44].Впоследствии выделенную ДНК использовали для измерения IRMS и ультрацентрифугирования в градиенте плотности.

Измерение

¹³ C Обогащение ДНК с помощью IRMS Соотношение изотопов углерода
может быть надежным индикатором обогащения ¹³ С в экстрагированных нуклеиновых кислотах. Состав ¹³ C определяли с помощью сопряженного анализатора элементов/масс-спектрометрии соотношения изотопов (EA/IRMS). Образцы очищенной ДНК помещали в оловянные капсулы объемом 0,04 мл (3,5×5 мм, HEKAtech GmbH, Вегберг, Германия) и сушили в течение ночи.Образцы полностью конвертировались в CO ₂ , N ₂ и H ₂ O после сжигания (окисление при 1020°С, восстановление при 650°С) в постоянном токе гелия (80 мл мин ^-1) методом с использованием элементного анализатора (EuroEA CN2 dual, HEKAtech GmbH). После прохождения через ловушку для воды (MgClO ₄) газы хроматографически разделяли при 85°C и переносили через разделительный клапан в масс-спектрометр со связанными изотопами (IRMS) (IsoPrime, Micromass, Manchester, UK). Стандарт ацетанилида был откалиброван по международному стандарту Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) с использованием NBS 22 (эталонный материал МАГАТЭ) со значением δ ¹³ C, равным –30,03‰ [45]. В качестве заготовок использовались пустые жестяные капсулы. Каждый образец анализировали в трех повторностях. Изотопные отношения выражаются в дельта-обозначении следующим образом [46]:
Разделение
¹³ С-меченой ДНК по плотности
Разложение выделенной ДНК в зависимости от плотности проводилось в растворе хлорида цезия (CsCl, Sigma-Aldrich) со средней плотностью 1.725 г мл ^-1 с использованием опубликованного протокола [8]. Вкратце, примерно 1500 нг очищенной ДНК загружали в среду для центрифугирования CsCl, помещали в пробирку Quick-Seal объемом 5,1 мл (Beckmann, Fullerton, CA, USA) и закрывали. Все образцы были настроены с одной и той же партией среды CsCl и запускались параллельно, чтобы свести к минимуму возможные отклонения. ¹³ С-меченую ДНК отделяли изопикническим ультрацентрифугированием при 50000 об/мин. в роторе НВТ90 в ультрацентрифуге Optima L-90K (Beckmann) при 20°С в течение 40 ч под вакуумом и в последующем образовавшиеся градиенты плотности фракционировали снизу вверх на 12 равных фракций (по 425 мкл) вытеснением сверху водой с использованием ВЭЖХ-насоса при скорости потока 850 мкл/мин ^-1 (система Agilent HP1100, Вальдброн, Германия) (рис.2А). Плотность фракции определяли путем взвешивания аликвоты каждой фракции, и последнюю фракцию, содержащую воду, исключали из градиентного анализа фракций по плотности. После этого из каждой фракции осаждали ДНК, повторно растворяли в воде, не содержащей нуклеаз, и количественно определяли, как указано выше, для последующего анализа микробного сообщества. Распределение ДНК в данном образце рассчитывали как количество соответствующей фракции, деленное на общее количество ДНК всех фракций в образце, чтобы облегчить сравнение градиентов.
Отпечатки пальцев гена 16S рРНК в градиентных фракциях с помощью DGGE
Разделенные градиентные фракции подвергали скринингу на наличие различий в составе бактериального сообщества с помощью анализа денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE). Бактериальный ген 16S рРНК амплифицировали из всех фракций в два этапа в виде гнездовой ПЦР с набором праймеров 27f/1492r и 968F/1401R (таблица S1). DGGE выполняли с помощью системы DCode (Bio-Rad, Мюнхен, Германия). Примерно равные количества продуктов ПЦР (300 нг) наносили на 8% полиакриламидный гель с градиентом денатурации от 20 до 80% (100% денатуранта составляла 7 М мочевина и 40% (об./об.) деионизированного формамида).Электрофорез проводили в 1×ТАЕ-буфере при 100 В в течение 16 ч при 60°С, и гели окрашивали в течение 30 мин в 0,5×ТАЕ-буфере красителем геля нуклеиновой кислоты SYBR-Gold (Invitrogen, Карлсруэ, Германия) для фотографирования. Модели DGGE сравнивали для оценки изменчивости структуры бактериального сообщества между меченым лечением и контролем. Поскольку профили DGGE показывали разницу в градиентах меченой обработки, соответствующие фракции объединяли для получения одной тяжелой (4–5), одной средней (7) и одной легкой (9–11) фракций плотности ДНК из каждого образца.
Пиросеквенирование ампликона FLX с бактериальной меткой (bTEFAP) и молекулярный филогенетический анализ
репрезентативных градиента были подвергнуты пиросеквенированию, как описано ранее [47], [48]. По сути, гипервариабельная часть V1–V3 в рДНК 16S была амплифицирована с использованием пары праймеров Gray28F/519r и секвенирована с использованием стратегии Roche 454 FLX Titanium (таблица S1). Программный пакет Quantitative Insight in Microbial Ecology (QIIME, версия 1.4.0) использовали для обработки данных секвенирования и расчета разнообразия [49], [50].Последовательности предварительно прошли контроль качества для удаления возможных артефактов и ошибок (в нашем анализе использовался скрипт denoise_wrapper.py) и вырезали часть с низким качеством [51]. Более поздние химеры (метод обнаружения: ChimeraSlayer) и чтения с низким содержанием (<0,1%) были удалены из анализа [52]. Высококачественные чтения были сгруппированы в операционные таксономические единицы (OTU) с использованием UCLUST с порогом сходства 97% [53]. Для каждой OTU была извлечена одна репрезентативная последовательность, и классификатор RDP использовался для определения наивысшего разрешения таксономии на основе проекта рибосомной базы данных. Наконец, была создана таблица OTU, описывающая встречаемость бактериальных филотипов в образце. Репрезентативные последовательности были сопоставлены с эталонными последовательностями, полученными из базы данных нуклеотидов NCBI, с использованием алгоритма ClustalW. Идентификацию OTU, значительно различающихся по численности, проводили в METASTATS с использованием непараметрического t -критерия по таксономическим данным, извлеченным из QIIME. Уровень значимости для порога (значение P) был установлен на уровне 0,05 [54]. Филогенетические деревья были рассчитаны с использованием метода максимального правдоподобия (модель Тамура-Ней) и метода Neighbor-Joining с 1000 повторами начальной загрузки в MEGA5 [55].
Флуоресценция
in situ Гибридизация (FISH)
Чтобы локализовать доминирующие симбионты кишечника, FISH был выполнен на тонких 5 мкм поперечных срезах холодной полимеризующейся смолы (Technovit 8100, Heraeus Kulzer GmbH, Wehrheim, Germany), встроенной в ткани кишечника. Тестировали специфичность зондов и создавали условия гибридизации, как описано [11]. Вскоре предметное стекло гибридизовали с 1,5 мМ каждого зонда (таблица S1) в гибридизационном буфере, содержащем 900 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 20% формамид, 1% SDS. Для обнаружения использовали FITC-меченый общий зонд эубактерий и Cy3-меченый зонд Enterococcus , а изображения получали с помощью микроскопа Axio Imager Z1 (Carl Zeiss, Йена, Германия) [56]–[58].
Биотесты на антибиотики
Enterococci были выделены из кишечника хлопковой листовертки с помощью Enterococcus -селективного агарового планшета (Fluka, Мюнхен, Германия), а ген 16S рРНК был амплифицирован и секвенирован. Антимикробную активность выделенных штаммов в отношении различных индикаторных бактерий оценивали с помощью диффузионного анализа в агаре.Ночной супернатант культуры штамма E. mundtii в бульоне MRS (Roth, Карлсруэ, Германия) при 30°C доводили до pH 7,0 и фильтровали через мембрану 0,22 мкм PVDF. В чашке с агаром BHI (Roth), инокулированной индикаторными штаммами ( Micrococcus luteus или Leuconostoc mesenteroides ), вырезали отверстия (диаметром 6 мм) и заполняли 60 мкл культуральных фильтратов E. mundtii . Чашки с агаром инкубировали при 30°С в течение 24 ч, антимикробную активность определяли по образованию просветов вокруг загрузочных отверстий.
Регистрационные номера последовательностей нуклеотидов
Данные пиросеквенирования депонированы в кратком архиве NCBI GenBank под номером доступа. SRA057979.
Вспомогательная информация
Рисунок S3.
DGGE-фингерпринтинг фракций градиента с выявленной плотностью из маркировки ¹³ C-глюкозы и нативного контроля глюкозы (¹² C-глюкоза). (а) Фракция-зависимый ПЦР-анализ амплификации бактериального гена 16S рРНК.Фракции (1–12) были получены из выявленных по плотности градиентов обработки мечением (+ ¹³ С) или контроля (+ ¹² С). Повышенная интенсивность полосы наблюдалась в тяжелых фракциях при обработке мечением. ( б ) Профиль DGGE бактериальных генов 16S рРНК в градиентах обработки мечением и ( с ) контроля. Стрелки указывают на заметные изменения в составе сообщества после маркировки.
10.1371/journal.pone.0085948.s004
(TIF)
Рисунок S4.
Обнаружение грибов и архей в кишечнике Spodoptera littoralis . Гель-электрофорез показывает отсутствие продуктов амплификации с праймерами, специфичными для грибов и архей. При попытке культивирования грибов использовали три вида чашек с обычным агаром для выращивания грибов (KM, агар Кемплера-Маккея; PDA, картофельно-декстрозный агар; PNM, питательная среда для растений), и ни один гриб не был обнаружен.
10.1371/journal.pone.0085948.s005
(TIF)
Рисунок S5.
Изображения Enterococcus sp. из S. littoralis выявляют локализацию бактерий в кишечнике и антимикробную активность. (a) FISH с Cy3-меченым зондом Enterococcus (желтый) показывает высокую плотность бактериальных клеток, прилипших к слизистому слою, выстилающему эпителий кишечника, и это при более высоком увеличении (63 × 10) (b). Белая стрелка указывает на ткань эпителия кишечника. Белая стрелка указывает на просвет кишки.(c) Анализ диффузии в агар показывает культуральные фильтраты Enterococcus против Micrococcus luteus и (d) Leuconostoc mesenteroides . Антимикробную активность выявляют по образованию просвета вокруг загрузочного отверстия.
10.1371/journal.pone.0085948.s006
(TIF)
Рисунок S6.
Микрофлора кишечника S. littoralis личинок, питавшихся белой фасолью. Метагеномную ДНК экстрагировали из цельной ткани кишечника и секвенировали без ультрацентрифугирования в градиенте цезия.
10.1371/journal.pone.0085948.s007
(TIF)
Благодарности
Мы благодарим Анжелику Берг за лабораторную помощь, Сайлендхарана Судакарана и Мартина Калтенпота за помощь в пиросеквенировании. Кристиан Кост выражает благодарность за подробные комментарии к этой работе. Мы также благодарим Эмили Уилер за редакционную помощь.
Авторские взносы
Идея и разработка экспериментов: Ю.С. ЕАК ВБ. Выполнены опыты: YS EAC HG SB.Проанализированы данные: YS EAC WB. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: SB. Написал статью: YS EAC WB.
Каталожные номера
1. Клементе Дж. К., Урселл Л. К., Парфри Л. В., Найт Р. (2012) Влияние микробиоты кишечника на здоровье человека: комплексный взгляд. Ячейка 148: 1258–1270.
2. Диллон Р.Дж., Диллон В.М. (2004)Кишечные бактерии насекомых: непатогенные взаимодействия. Анну Рев Энтомол 49: 71–92.
3. Структура, функции и разнообразие микробиома здорового человека. Природа 486: 207–214.
4. Poulsen M, Sapountzis P (2012) За каждым большим муравьем стоит большой кишечник. Мол Экол 21: 2054–2057.
5. Райхардт Н., Барклай А.Р., Уивер Л.Т., Моррисон Д.Дж. (2011) Использование стабильных изотопов для измерения метаболической активности кишечной микробиоты человека. Прикладная и экологическая микробиология 77: 8009–8014.
6. Dumont MG, Murrell JC (2005)Исследование стабильных изотопов — связь микробной идентичности с функцией.Nat Rev Microbiol 3: 499–504.
7. Радаевски С., Инесон П., Парех Н.Р., Мюррелл Дж.К. (2000)Исследование стабильных изотопов как инструмент микробной экологии. Природа 403: 646–649.
8. Neufeld JD, Vohra J, Dumont MG, Lueders T, Manefield M, et al. (2007) Исследование стабильных изотопов ДНК. Нацпроток 2: 860–866.
9. Brinkmann N, Martens R, Tebbe CC (2008)Происхождение и разнообразие метаболически активных кишечных бактерий из выведенных в лаборатории личинок Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera, Insecta). Appl Environ Microbiol 74: 7189–7196.
10. Пиллони Г., фон Нетцер Ф., Энгель М., Людерс Т. (2011) Электронно-акцепторная идентификация ключевых анаэробных деструкторов толуола в водоносном горизонте, загрязненном битумной нефтью, с помощью Pyro-SIP. FEMS Microbiol Ecol
11. Тан X, Фрейтак Д, Фогель Х, Пинг Л, Шао Ю и др. (2012)Сложность и изменчивость комменсальной микробиоты кишечника у многоядных личинок чешуекрылых. PLoS One 7: e36978.
12. Пинг Л., Бухлер Р., Митофер А., Сватос А., Спителлер Д. и др.(2007)Новый белок типа Dps из кишечных бактерий насекомых катализирует гидролиз и синтез N-ациламинокислот. Environ Microbiol 9: 1572–1583.
13. Песек Дж., Бухлер Р., Альбрехт Р., Боланд В., Зет К. (2011)Структура и механизм транслокации железа белком Dps из Microbacterium arborescens. J Biol Chem 286: 34872–34882.
14. Шао И., Спителлер Д., Тан Х., Пинг Л., Колеси С. и др. (2011)Кристаллизация альфа- и бета-каротина в передней кишке личинок Spodoptera, питающихся токсичным пищевым растением. Insect Biochem Mol Biol 41: 273–281.
15. Zhang W, He HB, Zhang XD (2007)Определение нейтральных сахаров в почве с помощью капиллярной газовой хроматографии после дериватизации в ацетаты альдононитрила. Биология и биохимия почвы 39: 2665–2669.
16. Прайс Н.П. (2004)Производные ацилового сахара для ГХ/МС анализа обогащения 13С в процессе углеводного обмена. Анальная химия 76: 6566–6574.
17. Lueders T, Manefield M, Friedrich MW (2004)Повышенная чувствительность исследования стабильных изотопов на основе ДНК и рРНК путем фракционирования и количественного анализа градиентов изопикнического центрифугирования.Environ Microbiol 6: 73–78.
18. Фиерер Н., Джексон Р.Б. (2006) Разнообразие и биогеография почвенных бактериальных сообществ. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 103: 626–631.
19. Бенсон А.К., Келли С.А., Легге Р., Ма Ф., Лоу С.Дж. и др. (2010) Индивидуальность состава микробиоты кишечника представляет собой сложный полигенный признак, формируемый множеством факторов окружающей среды и генетических факторов хозяина. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 18933–18938.
20. Дрейк Х.Л., Вуст П.К., Хорн М.А. (2011) Clostridiaceae и Enterobacteriaceae как активные ферментеры в содержимом кишечника дождевого червя. Журнал Исме 5: 92–106.
21. Lu Y, Conrad R (2005) Исследование стабильных изотопов на месте метаногенных архей в ризосфере риса. Наука 309: 1088–1090.
22. Функе М., Бухлер Р., Махобиа В., Шнееберг А., Рамм М. и др. (2008)Быстрый гидролиз молекул, чувствительных к кворуму, в кишечнике личинок чешуекрылых.Чембиохим 9: 1953–1959.
23. Ковачева-Датчари П., Эгерт М., Маатуис А., Раджилич-Стоянович М., де Грааф А.А. и соавт. (2009)Связывание филогенетической идентичности бактерий с ферментацией крахмала в модели толстой кишки in vitro с помощью зондирования стабильных изотопов на основе РНК. Environ Microbiol 11: 914–926.
24. Wong CN, Ng P, Douglas AE (2011)Бактериальное сообщество с низким разнообразием в кишечнике дрозофилы Drosophila melanogaster. Environ Microbiol 13: 1889–1900.
25. Мартинсон В.Г., Дэнфорт Б.Н., Минкли Р.Л., Руппелл О., Тингек С. и соавт. (2011) Простая и характерная микробиота, связанная с медоносными пчелами и шмелями. Мол Экол 20: 619–628.
26. Робинсон С.Дж., Шлосс П., Рамос Й., Раффа К., Хандельсман Дж. (2010)Надежность бактериального сообщества в средней кишке личинки капустной белокочанной бабочки. Микроб Экол 59: 199–211.
27. Рассел Дж. А., Моро С. С., Голдман-Уэртас Б., Фудзивара М., Ломан Д. Д. и др.(2009) Бактериальные кишечные симбионты тесно связаны с эволюцией травоядных у муравьев. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 21236–21241.
28. Warnecke F, Luginbuhl P, Ivanova N, Ghassemian M, Richardson TH, et al. (2007) Метагеномный и функциональный анализ микробиоты задней кишки высшего термита, питающегося древесиной. Природа 450: 560–565.
29. Перкинс Г.А., ден Баккер Х.К., Бертон А.Дж., Эрб Х.Н., Макдонаф С. П. и др. (2012) Желудки лошадей содержат обильную и разнообразную микробиоту слизистой оболочки.Appl Environ Microbiol 78: 2522–2532.
30. Эгерт М., Стингл У., Бруун Л.Д., Поммеренке Б., Брюн А. и соавт. (2005)Структура и топология микробных сообществ в основных отделах кишечника личинок Melolontha melolontha (Coleoptera: Scarabaeidae). Appl Environ Microbiol 71: 4556–4566.
31. Пауше И., Уилкинсон П., Фогель Х., Нельсон Д.Р., Рейнольдс С.Е. и соавт. (2010) Пиросеквенирование транскриптома средней кишки личинки Manduca sexta: сообщения для пищеварения, детоксикации и защиты.Насекомое Мол Биол 19: 61–75.
32. Ананд А.А.П., Веннисон С.Дж., Санкар С.Г., Прабху Д.И.Г., Васан П.Т. и др. (2010)Выделение и характеристика бактерий из кишечника Bombyx mori, которые разлагают целлюлозу, ксилан, пектин и крахмал, и их влияние на пищеварение. Журнал науки о насекомых 10.
33. Адамс А.С., Джордан М.С., Адамс С.М. , Суен Г., Гудвин Л.А. и др. (2011)Бактерии, разлагающие целлюлозу, связанные с инвазивной древоточцем Sirex noctilio. ИСМЕ J 5: 1323–1331.
34. Энгель П., Мартинсон В.Г., Моран Н.А. (2012)Функциональное разнообразие простой микробиоты кишечника медоносной пчелы. Proc Natl Acad Sci U S A 109: 11002–11007.
35. Ватанабэ Х., Токуда Г. (2010) Целлюлолитические системы у насекомых. Анну Рев Энтомол 55: 609–632.
36. Атараши К., Таноуэ Т., Сима Т., Имаока А., Кувахара Т. и др. (2011)Индукция регуляторных Т-клеток толстой кишки местными видами Clostridium. Наука 331: 337–341.
37.Джонс С.Э., Леннон Дж.Т. (2010) Покой способствует поддержанию микробного разнообразия. Proc Natl Acad Sci USA 107: 5881–5886.
38. Васкес А., Форсгрен Э., Фрайс И., Пакстон Р.Дж., Флаберг Э. и др. (2012) Симбионты как основные регуляторы здоровья насекомых: молочнокислые бактерии и пчелы. PLoS One 7: e33188.
39. Прия Н.Г., Оджа А., Кайла М.К., Радж А., Раджагопал Р. (2012) Изменчивость кишечных бактерий Helicoverpa armigera, вызванная растением-хозяином. ПЛОС Один 7.
40. Бродерик Н.А., Раффа К.Ф., Гудман Р.М., Хандельсман Дж. (2004)Перепись бактериального сообщества средней кишки личинок непарного шелкопряда с использованием культивирования и независимых от культивирования методов. Appl Environ Microbiol 70: 293–300.
41. Кох Х., Шмид-Хемпель П. (2011)Кишечная микробиота, передающаяся социально, защищает шмелей от кишечных паразитов. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 19288–19292.
42. Сильверман Н., Пакетт Н. (2008) Иммунология.Правильные резидентные ошибки. Наука 319: 734–735.
43. Хорн М.А., Шрамм А., Дрейк Х.Л. (2003) Кишечник дождевого червя: идеальная среда обитания для проглоченных микроорганизмов, продуцирующих N2O. Appl Environ Microbiol 69: 1662–1669.
44. Anderson IC, Cairney JWG (2004) Разнообразие и экология почвенных грибковых сообществ: более глубокое понимание посредством применения молекулярных методов. Экологическая микробиология 6: 769–779.
45. Coplen TB, Brand WA, Gehre M, Groning M, Meijer HAJ и соавт.(2006) Новые рекомендации по измерению дельты C-13. Анальная химия 78: 2439–2441.
46. Ленхарт К., Бунге М., Рейтеринг С., Ной Т.Р., Шуттманн И. и др. (2012) Доказательства образования метана сапротрофными грибами. Нацкоммуна 3: 1046.
47. Исхак Х.Д., Плауз Р., Сен Р., Келлнер К., Мейер Э. и др. (2011) Бактериальное разнообразие в колониях муравьев Solenopsis invicta и Solenopsis geminata, охарактеризованное пиросеквенированием ампликона 16S 454. Микроб Экол 61: 821–831.
48.Судакаран С., Салем Х., Кост С., Калтенпот М. (2012)Географическая и экологическая стабильность симбиотической микробиоты средней кишки у европейских огненных жуков, Pyrrhocoris apterus (Hemiptera, Pyrrhocoridae). Мол Экол
49. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, et al. (2010) QIIME позволяет анализировать данные высокопроизводительного секвенирования сообщества. Нат-методы 7: 335–336.
50. Карденас П.А., Купер П.Дж., Кокс М.Дж., Чико М., Ариас С. и др.(2012)Микробиота верхних дыхательных путей при хрипах без антибиотиков и у здоровых младенцев из тропиков сельской местности Эквадора. PLoS One 7: e46803.
51. Ридер Дж., Найт Р. (2010) Быстрое шумоподавление при пиросеквенировании ампликонов считывается с использованием распределений рангов и изобилия. Нат-методы 7: 668–669.
52. Хаас Б.Дж., Геверс Д., Эрл А.М., Фельдгарден М., Уорд Д.В. и др. (2011)Формирование и обнаружение химерной последовательности 16S рРНК в ампликонах Сэнгера и 454-пиросеквенированных ПЦР.Геном Res 21: 494–504.
53. Edgar RC (2010) Поиск и кластеризация на несколько порядков быстрее, чем BLAST. Биоинформатика 26: 2460–2461.
54. Уайт Дж. Р., Нагараджан Н., Поп М. (2009) Статистические методы обнаружения дифференциально-обильных признаков в клинических метагеномных образцах. Плос Вычислительная биология 5.
55. Тамура К., Петерсон Д., Петерсон Н., Стечер Г., Ней М. и др. (2011) MEGA5: Молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционного расстояния и максимальной экономии.Мол Биол Эвол 28: 2731–2739.
56. Манеро А., Бланч А.Р. (2002) Идентификация Enterococcus spp. на основе специфической гибридизации с зондами 16S рДНК. J Microbiol Methods 50: 115–121.
57. Бер Т., Кооб С., Шедл М., Мелен А., Мейер Х. и др. (2000) Вложенный массив целевых зондов рРНК для обнаружения и идентификации энтерококков путем обратной гибридизации. Syst Appl Microbiol 23: 563–572.
58. Аманн Р.И., Биндер Б.Дж., Олсон Р.Дж., Чизхолм С.В., Деверо Р. и соавт.(1990) Комбинация олигонуклеотидных зондов, нацеленных на 16S рРНК, с проточной цитометрией для анализа смешанных микробных популяций. Appl Environ Microbiol 56: 1919–1925.
.