Фитофторин инструкция по применению отзывы: Страница не найдена | ОгородСадовод.ком

Биофунгицид Фитоспорин-М, ПС от болезней 200 гр

Биофунгицид Фитоспорин-М, ПС от болезней 200 гр – паста, биофунгицид для защиты, профилактики и лечения растений и посадочного материала от грибных и бактериальных болезней: фитофтороза, корневой гнили, параши, мучнистой росы, черной ножки, ржавчины и др.

Описание:

Фитоспорин-М, ПС (паста). Универсальный. Защита от болезней и ростоускорение.

Биофунгицид для защиты, профилактики и лечения растений и посадочного материала от грибных и бактериальных болезней: фитофтороза, корневой гнили, параши, мучнистой росы, черной ножки, ржавчины и других, для личных подсобных хозяйств. Эффективность Фитоспорина-М усилена эликсиром плодородия ГУМИ.

600 литров на 1-6 соток.

Титр не менее 100 млн живых клеток и спор/г, Bacillus subtilis, штамм 26Д.

Применение:

Содержимое пакета (200 г) развести в 400 мл (2 стакана) воды, тщательно перемешивая.

Разведенный Фитоспорин-М, ПС применять:

— для замачивания семян, черенков, корней, луковиц, 2-4 капли на стакан воды;

— для опрыскивания растений, 2-3 чайные ложки на 10 л воды на 100 м²;

— для полива почвы при перекопке 1 ст. ложка на 10 л воды на 2 м².

— для обработки компоста 1 ст. ложка на 50 кг компостной массы.

Норма расхода разведенного препарата по культурам в соответствии с таблицей:

Картофель	4 ст. ложки (60 мл) на 1,5 стакана (300 мл) воды на 10 кг	Предпосадочное опрыскивание клубней.
	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 100 м²	Опрыскивание в период вегетации: профилактическое в фазах смывания рядков – бутонизация, повторно через 10-15 дней.
Капуста	2 капли на 1/2 стакана (100 мл) воды	Предпосевное замачивание семян на 1-2 часа.
	1 чайная ложка (3 мл) на 1 л воды на 100 м²	Погружение корней рассады на 1-2 часа перед высадкой в грунт.
	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 100 м²	Опрыскивание через 7-10 дней после высадки в грунт и повторно через 2-3 недели.
Томаты	1 капля на 1/2 стакана (100 мл) воды	Предпосевное замачивание семян на 1-2 часа.
	1 ст. ложка (15 мл) на 10 л воды 1 л на 100 растений при погружении 1 стакан (200 мл) на растение при поливе	Погружение корней рассады на 1-2 часа перед высадкой в грунт или полив рассады под корень через 3 дня после высадки в грунт.
	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 100 м²	Опрыскивание в период вегетации: 1-е профилактическое, следующее через 10-15 дней.
Огурцы	2 капли на 1/2 стакана (100 мл) воды	Предпосевное замачивание семян на 1-2 часа.
	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 100 м²	Опрыскивание в период вегетации 3-кратно: 1-е профилактическое, далее с интервалом 10-15 дней.
Садовые цветы	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 100 м²	Опрыскивание в период вегетации.
	2-3 чайные ложки (6-10 мл) на 10 л воды на 10 растений	Полив под корень больного растения.
Комнатные растения	10 капель на 1 л воды	Опрыскивание в период вегетации.
	15 капель на 1 л воды на 10 растений	Полив под корень больного растения.

Разведенный препарат можно использовать в течение сезона. Нет срока ожидания (обработанную продукцию можно употреблять в пищу в день обработки).

Меры предосторожности: Не фитотоксичен. Малоопасный препарат – 4 кл. При работе с препаратом соблюдать правила личной гигиены. Работать в резиновых перчатках. При попадании препарата на кожу или слизистые оболочки – промыть водой, при проглатывании – промыть желудок водой. Хранить отдельно от пищевых продуктов. Допускается хранить препарат при температуре от – 20°С до + 30°С. Использованные пакеты утилизировать с бытовыми отходами. Кл. опасности для пчел – 3 (малоопасный).

Масса: 200 гр.

Гарантийный срок хранения: 4 года.

Срок годности – 4 года.

Производитель: Россия.

Вы можете купить Фитоспорин-М, ПС от болезней и ростоускорение 200 гр с доставкой курьером по Москве, оформив заказ через корзину.

Препарат Фитоспорин – инструкция по применению и отзывы

Фитоспорин наилучший микробиологический препарат для борьбы с бактериальными и грибковыми поражениями садовых, огородных и комнатных растений. Фунгицид экологически чистый и абсолютно безопасен для людей и всего окружающего.

Содержание статьи:

Описание препарата

Основной компонент этого средства является Bacillus Subtilis, более известно как штамм 26D. Это живая клетка почвенной бактерии. Споры, которые содержаться в Фитоспорине, взаимодействуя с растением, пропитываются внутрь него и не дают размножаться патогенной флоре.

Для вязкости, в качестве дополнительного компонента в Фитоспорин добавляют мел. В зависимости от марки средства, препарат содержит комплекс макроэлементов, гуминовые кислоты и бурый уголь.

Обработку растения данным фунгицидом можно проводить на любом этапе вегетации. Препарат эффективен абсолютно для всей растительности без исключения.

Для удобства потребителей Фитоспорин выпускают в порошкообразном виде, в небольших пакетиках по 10-30 грамм. Так же в виде пасты двух сот граммовой фасовки и в жидком виде.

Фитоспорин-М

В инструкции по применению Фитоспорин-М сказано, что по способу его воздействия на растительность, он считается системным препаратом. Он обладает способностью работать не только по поверхности культуры, но и глубоко проникать по всей сосудистой системе. Оказывая при этом, угнетающее действие на разные возбудители болезней.

В инструкции по применению Фитоспорина в порошке говориться о том, что разводить его нужно только талой, дождевой, кипяченой или очищенной теплой водичкой, в соотношении 1 к 2 (рабочий раствор). Нельзя использовать проточную воду из крана. Она хлорированная, это губительно для живых бактерий. После разведения порошкообразной массы, нужно оставить препарат на несколько часов, чтобы дать возможность бактериям пробудиться и активизироваться. Если просто посыпать землю порошком, никакого эффекта не будет.

В инструкция по применению Фитоспорина пасты сказано, что ее нужно разводить за несколько дней до использования. Если готовым раствором нужно опрыскать деревья, кусты или цветы, к нему добавляют несколько капель жидкого мыла. Это улучшить прилипание средства к листочкам.

Фитоспорин в жидкой форме разбавлять водой не нужно. Его зачастую используют для обработки комнатных цветников, зимних садов и оранжерей. Так же им обрабатывают луковичные цветы при высадке в открытый грунт.

Фитоспорин в жидкой форме

Фитоспорин-М применяется не только во время лечения, но и для профилактических обработок растений от всех видов грибковых гнилей (плодовая и сухая фузариозная, белая, серая и черная сухая).

Подобные заражения клубнеплодов и луковичных культур часто возникают во время хранения.

Препарат Фотоспорин-М применяют во время заражения огородных и садовых культур такими заболеваниями как церкоспороз, снежной плесенью, фомоза и ризоктониоза, бурой ржавчиной. Альтернариоза, бактериоза и септориоза. Против мокрой и сухой, черной и коричневой, пеницелезной и фузариозной гнили. А так же американской и ложной мучнистой росы.

В начале весеннего сезона Фитоспорин-М применяют для обработки семенного материала. Корни саженцев, особенно если деревца и кустарники куплены у незнакомых людей. Корневую систему рассады перед высадкой, чтобы не случилось заражения растения на грядках. Фитоспорином обрабатывают землю перед началом посева семян.

Обработка семенного материала препаратом Фитоспорин-М

Так как препарат практически не токсичен, его без опасения можно использовать в квартирах и небольших помещениях для обработки комнатных цветов. Фитоспорин-М по-разному воздействует на растительность. В некоторых случаях его эффективность достигает почти 100%. Но бывает и такое, когда он менее действенный и процентное соотношение эффективности не превышает 70%. Агрономы утверждают, что это тоже очень хороший результат и культура непременно оздоравливается.

Отзывы садоводов и огородников только положительные. Из достоинств выделяет следующее — применять Фитоспорин-М можно на протяжении всего вегетационного периода, не исключено время цветения и плодоношения.

Фитоспорин – М пастообразный можно использовать не всю сразу упаковку, а разделить пакет на две-три части, это очень удобно. Сама масса черного цвета, легко разводиться водой и окрашивается в коричневый цвет.

После вскрытия упаковки чувствуется запах аммиака. Не стоит этого пугаться, особенно тем, кто собирается обрабатывать комнатные цветы. После соединения с водой «аромат» быстро улетучивается.

У препарата есть один небольшой недостаток — сенная палочка, которая является основной составляющей препарата, практически не переносит прямого попадания солнечных лучей. Поэтому работать с фунгицидом нужно ближе к ночи или когда на улице пасмурно, но не дождливо.

Фитоспорин К — инструкция по применению

Фитоспорин-К Олимпийский (нано-гель) – эко препарат для всех видов садовых деревьев и кустов, огородных культур и комнатной зелени. Он насыщен фитобактериями, гуматом калия, минералами и микроэлементами.

Фитоспорин К

Фитоспорин-К напитывая растение, защищает от многих заболеваний, стрессов из-за перепада температуры воздуха. Жизнеспособность культур повышается, все насаждения значительно увеличиваются в росте. К тому же он поддерживает и укрепляет иммунную систему.

У огородных и садовых культур повышается засухоустойчивость. Зимующие деревья, кустарники и многолетние цветы более стойко переносят морозные зимы. После обработки растительности этим препаратов повышается лежкость фруктов, клубнеплодов и овощей.

Способ применения Фотоспорина-К следующий:

• Нужно содержимое пакета (200 гр.) развести в 400 гр. воды.
• Приготовленную смесь хорошо размешать и оставить на пару часов.

Фитоспорин для комнатных цветочков применяется для корневого полива и внекорневого опрыскивания. Чтобы пролечить корневую систему цветка нужно в двух литрах воды растворить 30 капель средства. Такого количества хватит для обработки 20 горшков. Для опрыскивания разводят 10 капель в одном литре очищенной теплой воды.

Применение Фитоспорина для полива комнатных растений

Чтобы обработать цветник на улице достаточно будет 5-6 чайных ложек на 20 литров талой или дождевой теплой воды.

Фитоспорин используют при выращивании рассады перцев, помидор и капусты. Для замачивания семян растворяют одну каплю препарата в половине стакана кипяченой теплой воды. Перед высадкой саженцев в открытый грунт нужно развести 1.5 чайной ложки Фитоспорина в одном литре воды и на несколько часов (2-3 не более) погрузить корешки в раствор.

Фитоспорин нельзя применять в комплексе с препаратами стимуляторами роста, удобрениями которые содержат в своем составе щелочь.

Способ хранения Фитоспорина

Этот препарат устойчив к очень низким и высоким температурам. Но все же для лучшей лежкости нужно убирать его в сухое и прохладное место. Самая оптимальная температура для хранения пасты и порошка не ниже +3 и не выше +30 градусов.

Бутилированный Фитоспорин (жидкий) сохраняется в темном месте комнатной температуры.

В разведенном Фитоспорине фитобактерии пробудились и активны. Поэтому его нужно использовать в течение суток. Далее бактерии просто поглотят друг друга и ценный препарат превратиться в обычную воду. Садоводы рекомендуют растворять только то количество, которое необходимо для обработки в данный момент времени.

Аналоги Фитоспорина

Существует аналог Препарата Фитоспорин – это ФитоДоктор. У средства высокая биологическая противовирусная, противовоспалительная и противогрибковая активность. Обрабатывая культуры препаратом, урожайность увеличивается. Его можно использовать весь вегетационный период, не нанеся вреда пчелам, птицам и животным.

Аналог Фитоспорина — ФитоДоктор

Он предназначен для обработки компостных ям, посевной земли на грядках, в парничках и теплицах. Для замачивания семян овощных культур и цветов, обработки корней рассады перед высаживанием ее на грядки. Обработки корневищ у саженцев деревьев и ягодников. Им обрабатывают овощехранилища перед складированием овощей и фруктов на зимний период.

Меры предосторожности

Работая на участке с препаратом нужно соблюдать меры предосторожности. Для этого во время полива и опрыскивания необходимо пользоваться респиратором. На руки надеть перчатки. При попадании раствора на кожу или в глаза почувствуется легкое жжение. Нужно сразу промыть место проточной водой. При промывании глазного яблока, желательно чтобы глаз был открыт. По окончанию вымыть руки с мылом.

БАШИНКОМ / Фитоспорин-М 0,110л рассада, овощи, ягоды суспензия 1/38

Лучший препарат для работы с рассадой Фитоспорин-М рассада, овощи, ягоды, плодовые — универсальный препарат для рассады и для выращивания овощей, ягод, плодовых. При 6-ти кратном опрыскивании 110 мл на 3 сотки; при 4-х кратном поливе на 50 растений; для замачивания семян, клубней, луковиц, корней рассады; опрыскивания и полива растений.

Флакон – 110 мл.
Срок годности 4 года.
Фитоспорин-М рассада, овощи, ягоды, плодовые — микробиологический препарат, предназначенный для защиты огородных, садовых, комнатных и оранжерейных растений от комплекса грибных и бактериальных болезней.

Препарат рекомендовано применяют по виду жидкостной суспензии: обработки семян до посадки, растительно-посадочный материал и систематическое опрыскивание как профилактика по растениям в фазе вегетации. Основой силы препарата есть живые клетки и мелкие споры полезных бактерии.
Фитоспорин-М рассада. Инструкция к применению:

— обеззараживает посадочные семена и материалы от грибковых, плесневидных видов грибов, болезненных возбудителей всевозможных гнилей и ещё комплекса болезней.
— проростки молодые и всходы оберегает от патогенных организмов из почвы.
— увеличивает стойкость растений.
— исключает заражение растения от возбудителей разных форм болезней и уничтожает их заражение по структуре тканей растения.

Применение Фитоспорина влияет на скорость прорастания семян ,стабильного роста всходов, стимулирует повышенно ускоренный рост , быстрое развитие растений. Эти свойства нужны культурам с небольшим периодом вегетации, недостатком влаги.

Способствует активной отдаче растений , объёмно влияет на сортовой потенциал, возможности вида, создавая приемлемые условия для образования урожая экологически чистого. Повышение урожая за счёт применения Фитоспорин м, можно поднять запланированную урожайность до 20% и более.

Эффективность препарата против болезней: сильного бактериального рака, гельминтоспориозных грибковых и неприятных фузариозных корневых видов гнилей, увядания, гоммоза,черной ножки, ризоктониоза, плесневения растений и гнили самих семян,полегания, снежной плесени, фитофтороза, мучнистой росы, сухой, мокрой формы гнили клубней, макроспориоз,бурой ржавчины, мягкой гнили распространяющейся в овощных культурах, альтернариоза и др.
Фитоспорин-М рассада применение, отзывы о препарате.

Фитоспорин м — это уникальный препарат которым обрабатывают и томат, картофель, цветы, от мучнистой россы крыжовник. Вообщем это такой много функциональный препарат и у каждого садовода должен иметься, фитоспорином постоянно необходимо пользоваться.

Препарат фитоспорин м бывает двух разных видов — порошок(серый) и паста(твёрдой формы) и многим непонятно как обрабатывать этими порошками и пастой. На самой упаковке написана инструкция где прописаны нормы расхода.

Порошок фитоспорина (он серого цвета), относится к видам биологических препаратов и для человека безвреден, есть так же паста 200 г. Инструкция на использование информирует что в препарате содержится более 100 мил. живых клеток и спор. Эти полезные микроорганизмы они подавляют нашу патогенную микрофлору, и грибковые бактериальные заболевания, которых очень много в садах, грядках огородов.
Как пользоваться препаратом Фитоспорин-М рассада?

Предпосевное замачивание рабочим раствором посадочного материала перед посевом (посадкой), в т. ч.: замачивание семян, черенков, корней, луковиц и клубнелуковиц. 4 капли жидкого препарата на стакан воды (200 мл).
Лучший препарат для работы с рассадой Фитоспорин-М рассада, овощи, ягоды, плодовые.

У рассады много разных болезней, в основном они грибковой природы. Чаще всего поражается корневая система. Общее название для них — корневые гнили.

Фитоспорин-М — микробиологический препарат, предназначенный для защиты огородных, садовых, комнатных и оранжерейных растений от комплекса грибных и бактериальных болезней.

Действующее вещество: Bacillus subtilis 26 Д, 100 млн. кл./г
Производитель:

БАШИНКОМ, НВП

Официальный представитель республика Крым ООО «Торговый дом»Геотек»

Под названием «Фитоспорин» выпускается ряд препаратов, основу которых составляет природная бактериальная культура.

Действующим веществом препаратов являются живые клетки и споры природной бактериальной культуры Bacillus subtilis 26 Д, 100 млн. кл./г. В качестве носителя бактериальной культуры используется состав на основе мела, различных наполнителей и ОД гумата в форме порошка ГУМИ. Присутствие в композиции ОД гумата усиливает фунгицидные свойства препарата и обеспечивает стабилизацию его характеристик в течение длительного срока, благодаря чему гарантийный срок хранения препарата от года до 2-х лет без потери своих качеств, а срок годности не ограничен.
Препаративная форма:

Выпускается вв виде жидкости в бутылочках.
Назначение:

Фитоспорин эффективен против широкого спектра грибных и бактериальных заболеваний, в том числе против парши, увядания, черной ножки, фитофтороза, плесневения семян, корневых гнилей, гнилей всходов, мучнистой росы, бурой ржавчины, пыльной головни, пузырчатой головни, альтернариоза, ризоктониоза, фузариоза, септориоза и многих других.
Способ применения:

Жидкий препарат приготовляют, растворив 1 часть пасты в 2-х частях простой нехлорированной воды. Для последующей обработки почвы, семян и растений полученный раствор также разводится водой.

Фитоспорин-М для цветов и комнатных растений, выпускаемый в виде жидкости в бутылочках (110 мл) перед применением просто разводится водой.

Основные способы применения:

Предпосевное замачивание рабочим раствором посадочного материала перед посевом (посадкой), в т.ч.: замачивание семян, черенков, корней, луковиц и клубнелуковиц. 4 капли жидкого препарата на стакан воды (200 мл).
Как вырастить крепкую, здоровую рассаду.

Крепкая, здоровая, выравненная рассада — мечта любого хозяина. Покупая семена на рассаду лучше выбирать гибриды: они более урожайны и устойчивы к болезням и стрессам. Но не забывайте, что семена гибридов собирать нельзя!

Выбранные семена замачивайте в биорастворе: семена заверните в 2 слоя марли, положите в блюдце и залейте биораствором (2 капли Гуми+10 капель Фитоспорин-М рассада на стакан воды). Фитоспорин-М рассада защитит растения, подавляя грибные и бактериальные заболевания, а Гуми повысит иммунитет, всхожесть, ускорит рост и развитие. Накройте смесь стеклом или пленкой и поставьте в теплое место.

Подготовка земли. Почвогрунты для выращивания рассады овощных культур должны содержать большой запас питательных веществ, нужных для роста и развития молодых проростков. Симптомы голодания растений по основным элементам питания (азот, фосфор и калий) проявляются в первую очередь на самых ранних стадиях развития. Наиболее яркий признак нехватки азота – пожелтение листьев из-за недостатка хлорофилла. При фосфорном голодании ослабевает проводящая система растений, ухудшается питание в целом. Недостаток калия делает растение недоразвитым, вялым, приземистым, снижается сопротивляемость вредителям и болезням.

Почвогрунт Земля-Матушка содержит биогенные (т.е. самые необходимые для жизни растений) элементы: азот, фосфор, калий, железо и жизненно важные микроэлементы – медь, цинк, кобальт, марганец. В его составе есть также торф, Гуми, питательное удобрение Хозяин-Батюшка и добавлены природные защитные фитобактерии Фитоспорина, а для рыхлости – керамические микропористые разрыхлители.

ВНИМАНИЕ! Не берите почву из-под деревьев в городских условиях. Избыток аммиака, тяжелых металлов и радионуклидов губительно сказывается на растениях, они просто чахнут. А для человека или домашнего животного такая почва в доме страшна еще тем, что она может быть инфицирована различными заболеваниями.

Рецепт идеальной почвы для рассады: насыпаем землю в таз, опрыскиваем ее биораствором (10 капель Гуми+1 ч.ложка Фитоспорин-М рассада на 1 л воды) при одновременном тщательном перемешивании, рыхлим руками до момента, когда земля комкуется, но не мажется. Почва станет пышной и плодородной, насыщенной воздухом, влагой, полезными защитными фитобактериями и гумусными веществами. Только потом засыпаем готовый грунт поверх дренажа.

Бросить семя в землю тоже надо уметь. Делаем канавки глубиной примерно 1 см через 3-4 см. Укладываем в них семена через 2-3 см, слегка опрыскивая землю биораствором. Поверх присыпаем сухой землей слоем примерно в 1 см, который ограничит испарения и стабилизирует температуру почвы. Укрываем ящик пленкой, чтобы не поливать до появления всходов, и ставим в теплое место.

Чтобы наша рассада подтянулась и окрепла, как только появится примерно 10% всходов (обычно на 3-4 день), укрытие надо снять и начать досвечивать. Даже таким маленьким росточкам требуется много света, а зимнее солнце, что мачеха: не греет да и светит коротко. Даже на подоконнике ростки получат не более 2000 люкс, а для полноценного развития им нужно в разы больше!

Светильник для рассады 3 урожая настройте на высоту около 5 см над рассадой и первые трое суток не выключайте. Растения будут получать освещенность в 10 тыс. люкс и активно формироваться. Следующие дни Светильник включаем на 14-16 часов в сутки с перерывами (например, утром и вечером). По мере роста рассады высоту Светильника нужно регулировать так, чтобы лампы были в 5 см от верхушек. Чем выше панель с лампами, тем меньше люксов получает растение. Оптимальная температура выращивания 20-22 ºС. При таком разумном «питательном» освещении рассада не просто вырастет, но и станет крепкой, здоровой и коренастой.

А СуперСветильник 5 урожаев ОЖЗ дает до 40 тыс. люкс, что позволяет вырастить и совершеннолетние растения, нуждающиеся в большем освещении (редис, земляника, кактусы и пр. )

Систематический обзор защитных реакций против фитофторы и стратегий борьбы с фитофторозом цитрусовых

виды фитофторы. являются возбудителями болезней гуммоза или прикорневой гнили, волокнистой корневой гнили и бурой гнили плодов, которые поражают корни, ствол и плоды цитрусовых деревьев, вызывая серьезные экономические потери. В этой работе представлен обновленный систематический обзор, посвященный защитным реакциям цитрусовых против фитофтороза и стратегиям борьбы с фитофторозом.Применение нового метода поиска, основанного на четкой, строгой и прозрачной методологии. С этой целью был проведен систематический обзор литературы с использованием баз данных, доступных для научных исследований. Основными механизмами защиты растений, о которых сообщается в цитируемых статьях, являются реакция гиперчувствительности, усиление клеточной стенки, продукция белков, связанных с патогенезом, и экспрессия генов, связанных с защитой. Кроме того, основными стратегиями борьбы с корневой гнилью Phytophthora являются органические соединения в почве и биологическая борьба с грибками и бактериями.Кроме того, также сообщалось об ингибировании гуммоза или язвы Phytophthora путем применения новых фунгицидов oomycota и снижении заболеваемости бурой плодовой гнилью за счет применения фосфита калия. Более того, современные методы биотехнологии растений могут помочь ускорить отбор устойчивых подвоев в программах селекции, таких как контролируемое скрещивание для получения гибридов, соматическая гибридизация, трансгенные цитрусовые растения, картирование геномных областей локусов количественных признаков (QTL), генов-кандидатов, метаболических маркеры и сравнительная транскриптомия.Эти инновационные методы представляют собой подходящий инструмент для выведения новых подвоев, устойчивых к фитофторе, которые широко признаны лучшей стратегией борьбы с гуммозом или корневой гнилью, волокнистой корневой гнилью и, в конечном счете, сводят к минимуму дорогостоящее использование пестицидов для защиты растений.

Борьба с фитофторой корневой гнили авокадо с помощью фосфита – обзор

Фосфит образуется в результате диссоциации ионов фосфоната. Фосфорат вводится агрономически либо путем инъекции, либо путем опрыскивания листвы.Первым химическим веществом, использованным для снабжения дерева фосфонат-ионами, был Fosetyl-Al. Это органофосфат, состоящий из анионов этилфосфоната и катионов алюминия. В более поздних разработках Fosetyl-Al был заменен растворами фосфоната калия (обычно называемого фосфористой кислотой или фосфоновой кислотой). Было высказано предположение, что сам фосфит может действовать непосредственно на организм Phytophthora, вызывая накопление избыточного количества полифосфата и пирофосфата. Накопление этих соединений вызывает угнетение важных клеточных процессов, что приводит к гибели организма (McDonald, Grant and Plaxton, 2001).Другие гипотезы предполагают, что помимо описанного выше существует еще несколько контрольных участков. Имеются взаимодействия с собственными защитными механизмами растений, а также с фосфитным и фитофторным организмом. Ион фосфита (h3PO3-) не используется растением в качестве замены фосфата (h3PO4-, HPO4), несмотря на неоднократные исследования, пытающиеся определить, может ли он использоваться, но, вероятно, он также полезен в качестве биостимулятора (Achary et al., 2017). Он может подавлять нормальную реакцию растений на дефицит фосфатов, например ускоренный рост корней (Gómez-Merino and Trejo-Téllez, 2015).

Ранние исследования показали преимущества «подавляющих почв» в борьбе с фитофторой в 1974 году, а также были получены некоторые подвои, устойчивые к корневой гнили. Исследования в области химической борьбы начались в конце 1970-х годов с использования металаксила для обработки почвы (Broadbent and Baker, 1974; Allen et al., 1980; Ben-Yaacov and Michelson, 1995). Металаксил представляет собой системный фунгицид широкого спектра действия, обычно используемый для борьбы с оомицетами (что и представляет собой фитофтора). Металаксил, применяемый как к саженцам, так и к укоренившимся 7-летним деревьям, мог стимулировать усиленный рост питающих корней и был способен ненадолго подавить производство хламидоспор (репродуктивной структуры фитофторы).В 1983 году исследования в Южной Африке сравнили Fosetyl-Al и металаксил, применяемые в виде инъекций для деревьев, и обнаружили, что Fosetyl-Al приводит к большему уменьшению симптомов фитофторы, чем металаксил (Darvas, Torien and Milne, 1983). Сам рост корней в данном случае не измерялся. Было обнаружено, что пятилетнее внекорневое применение Fosetyl-Al, начиная с 1978 г. в Южной Африке, менее эффективно снижает инокулянт фитофторы, чем металаксил (применяемый в виде смачивания), но дает более здоровые деревья (Darvas, 1983), что указывает на взаимодействие с у растений есть защита от Fosetyl-Al.

В Квинсленде, Австралия, проводились дальнейшие исследования по использованию металаксила (пропитка почвы), Fosetyl-Al и фосфористой кислоты (оба инъекционные) для борьбы с фитофторой. Подобно более раннему исследованию в Южной Африке, металаксил был менее способен справляться с симптомами корневой гнили фитофторы, чем Fosetyl-Al и фосфористая кислота. В очень реальных условиях урожайность плодов после обработки металаксилом составила 4,3 кг с дерева по сравнению с 53,7 кг с дерева при обработке Fosetyl-Al и 55,4 кг с дерева при обработке 10%-ной фосфорной кислотой.При введении 20% фосфористой кислоты урожайность увеличилась до 67,5 кг с дерева (Pegg et al., 1987). Было обнаружено, что остаточный эффект на корнях сохраняется до трех лет, однако авторы с осторожностью отметили, что снижение чувствительности к фосфиту уже было замечено во Франции, и поэтому рекомендовали соблюдать осторожность при использовании этих химикатов. Именно по этой причине был разработан комплексный метод управления, называемый «Колесо Пегга»; сочетать использование химических веществ с преимуществами, которые дают «подавляющие почвы», открытые в 1974 году в северной Австралии.

В 1990-х годах последовала дальнейшая работа с фосфорной кислотой для улучшения техники, особенно в отношении сроков применения в связи с вегетативными и корневыми промываниями. Применение фосфористой кислоты в виде инъекции приводило к самым высоким уровням фосфита в корнях при применении к деревьям, у которых были только зрелые листья и не было активного прироста (Pegg and Whiley, 1990). Разница во времени существенна: уровни фосфита в корнях достигали только 6 мг кг-1, когда происходило вегетативное промывание, но достигали 30 мг кг-1 при применении, когда листья были зрелыми.Метод внекорневой подкормки также оценивался с 1998 по 2000 гг. (2001). Несмотря на то, что в некоторых случаях опрыскивание листвы было столь же эффективным, как и инъекция в ствол, оно оказалось не таким эффективным, когда дерево несло большую нагрузку урожая. Олени (сильная обрезка до основной структуры ствола) в сочетании с последующими опрыскиваниями листьев были очень эффективны для улучшения здоровья деревьев, проявляющих симптомы корневой гнили фитофторы.

Исследование показало, что на перемещение фосфоната по дереву влияет изменение силы поглощения.Эти знания теперь привели к текущей рекомендации применять фосфонат калия (фосфористая кислота) в осенне-зимний период, когда корни активно растут, а листья нет. В то время как фосфонат по-прежнему перемещается в листья сразу после применения в первые 24 часа, через несколько дней он перемещается к корням (Whiley et al., 1995). Вилли рекомендовал уровень фосфита в корнях 20-40 мг/кг для адекватного контроля. Это привело к текущей рекомендации минимального содержания фосфита в корнях 25 мг кг-1.Обратите внимание, что это минимальный целевой уровень. Уровень фосфита снижается медленно, поэтому для достижения этого уровня весной и летом требуется уровень до 150 мг/кг осенью и зимой.

Эту рекомендацию, возможно, придется изменить из-за снижения чувствительности фитофторы к фосфиту. В садах как в Южной Африке, так и в Австралии использование опрыскиваний фосфорной кислотой привело к снижению чувствительности к фосфиту (Duvenhage, 1994; Dobrowolski et al., 2008; Dann et al., 2017).Данные действительно показывают, что чувствительность сохраняется при более высоких уровнях корней выше 80 мг кг-1, поэтому это было предложено в качестве нового минимального уровня, необходимого для адекватного контроля (Грем Томас, Перс. Комм. 2019). Проверка уровней осуществляется путем тестирования кормовых корней в квалифицированной лаборатории. Когда уровни низкие, требуется больше приложений. Хотя вызывает беспокойство снижение чувствительности, было высказано предположение, что эффективность фосфита связана с взаимосвязью между растением, фитофторой и фосфитом; когда корень с высоким уровнем фосфита подвергается атаке фитофторы, он подвергается сверхчувствительной реакции и производит новые питающие корни взамен пораженных, тем самым обеспечивая сохранение корневой системы (Ken Pegg, Pers.комм. 2019). Другие исследования также показали, что фосфит усиливает защиту растений от патогена.

Несмотря на то, что более чем в одной публикации высказывается предположение об усилении защиты растения-хозяина, точная причина этого эффекта четко не объяснена. Наиболее прямое упоминание об этом эффекте содержится в исследованиях использования фосфита при выращивании рассады джарра. Было обнаружено, что при низком уровне фосфита в корнях защитные механизмы растений активировались (количественно определялось измерением защитных ферментов растений), в то время как при более высоких уровнях фосфита защитные механизмы растений не активировались (Jackson et al. , 2000). Еще одно интересное взаимодействие наблюдалось между концентрациями фосфатов и фосфитов. При наличии более высоких концентраций фосфата эффективность фосфита снижается (Ma and Mcleod, 2014). Смысл этого исследования заключается в том, что некоторые исследования воздействия фосфита на фитофтору, возможно, переоценили эффективность фосфита, поскольку в своих экспериментальных планах использовались низкие концентрации фосфата. Еще более высокие уровни фосфатов могут быть обнаружены в корнях в реальном мире, что говорит о том, что предстоит проделать еще большую работу по изучению взаимосвязи.

Многолетние исследования применения фосфористой кислоты привели к очень хорошей борьбе с фитофторой корневой гнили. В настоящее время известно, что наилучший контроль достигается при применении в период, когда корни растут, а листья нет, а именно осенью/зимой. Проверка корней была полезна в Австралии и может быть воспроизведена также в Южной Африке (Ma and Mcleod, 2014). Тестирование корней хорошо зарекомендовало себя и используется в Австралии и может обеспечить эффективный мониторинг уровней фосфита. Минимальный уровень фосфита в корнях необходимо поддерживать по крайней мере на уровне выше 25 мг/кг, но лучший контроль может быть достигнут при более высоком минимальном уровне 80-100 мг/кг. Хотя предлагаемое изменение на более высокие значения связано с появлением менее чувствительных изолятов фитофторы, было бы преждевременно говорить, что продолжительность жизни фосфита ограничена. Фосфит использовался в течение очень долгого времени и, вероятно, останется полезным еще много лет, особенно в сочетании с интегрированными процедурами управления, описанными в колесе Пегга.

Для получения дополнительной информации об использовании фосфита посетите веб-сайт Avocados Australia.

Ссылки

Acary, V.M.M. et al. (2017) «Фосфит: новое фосфорное удобрение для борьбы с сорняками и патогенами», Журнал биотехнологии растений, 15 (12), стр. 1493–1508. doi: 10.1111/pbi.12803.

Allen, R. N. et al. (1980) «Фунгицидный контроль заболеваний ананаса и авокадо, вызванных phytophthora cinnamomi», Австралийский журнал экспериментального сельского хозяйства, 20(102), стр. 119–124. doi: 10.1071/EA9800119.

Бен-Яков, А. и Майкельсон, Э. (1995) «Подвои авокадо», Обзоры садоводства, 17 (1383), стр. 381–429. doi: 10.1002/9780470650585.ch21.

Бродбент, П. и Бейкер, К.Ф. (1974) «Поведение Phytophthora cinnamomi в почве подавляющее и способствующее корневой гнили», Австралийский журнал сельскохозяйственных исследований, 25(1), стр. 121–137. дои: 10.1071/AR9740121.

Dann, E.K. et al. (2017) «Снижение зависимости от фосфонатов для борьбы с фитофторозной корневой гнилью», стр.18–23.

Дарвас, Дж. М. (1983) «Пять лет непрерывной химической борьбы с фитофторой корневой гнили авокадо», стр. 72–73.

Дарвас, Дж. М., Ториен, Дж. К. и Милн, Д. Л. (1983) «Инъекция укоренившихся деревьев авокадо для эффективного контроля фитофторозной корневой гнили», Калифорнийское общество авокадо, 67 (1955), стр. 141–146.

Добровольски М.П. и др. (2008) «Отбор на пониженную чувствительность к фосфиту у Phytophthora cinnamomi при длительном применении фунгицида», Патология растений, 57(5), стр. 928–936. doi: 10.1111/j.1365-3059.2008.01883.x.

Duvenhage, J.A. (1994) «Мониторинг устойчивости Phytophthora cinnamomi к Fosetyl-Al и h4PO3», Ежегодник Южноафриканской ассоциации производителей авокадо, стр. 35–37.

Гомес-Мерино, Ф. К. и Трехо-Теллез, Л. И. (2015) «Биостимулирующая активность фосфита в садоводстве», Scientia Horticulturae. Elsevier BV, 196, стр. 82–90. doi: 10.1016/j.scienta.2015.09.035.

Джексон Т.Дж. и др. (2000) «Действие фунгицида фосфита на Eucalyptus marginata, инокулированного Phytophthora cinnamomi», Патология растений, 49(1), стр.147–154. doi: 10.1046/j.1365-3059.2000.00422.x.

Ма, Дж. и Маклеод, А. (2014) «Чувствительность южноафриканской Phytophthora cinnamomi к фосфиту при различных концентрациях фосфата in vitro», стр. 75–80.

Макдональд, А. Э., Грант, Б. Р. и Плакстон, В. К. (2001) «Фосфит: его значение в сельском хозяйстве и влияние на реакцию растений на голодание по фосфатам», Журнал питания растений, 24 (10), стр. 1505–1520. doi: 10.1081/PLN-100106017.

Pegg, K.G. et al.(1987) «Сравнение фосетилаля, фосфористой кислоты и металаксила для долгосрочного контроля фитофторозной корневой гнили авокадо», Австралийский журнал экспериментального сельского хозяйства, 27 (3), стр. 471–474. дои: 10.1071/EA9870471.

Пегг, К. Г. и Уайли, А. В. (1990) «L», 19(4), стр. 122–124.

Вилли, А. В. и др. (1995) «Изменение силы поглощения влияет на транслокацию фосфонатов в деревьях авокадо (Persea americana Mill.)», Австралийский журнал сельскохозяйственных исследований. дои: 10.1071/AR9951079.

Границы | Исследование механизма устойчивости сои к фитофторозной инфекции с использованием методов машинного обучения

Введение

Соя является незаменимым продуктом с высоким содержанием белка, полезным растительным маслом и сырьем для основных продуктов для здоровья. Широко выращиваемые по всему миру и имеющие 5000-летнюю историю выращивания, соевые бобы являются неотъемлемой частью сельскохозяйственной продукции. В качестве жизненно важного исходного материала, связанного с народным хозяйством и средствами к существованию людей, соя является наиболее экономически выгодной культурой.Примечательно, что спрос на сою в Китае составляет около 110 млн тонн в год, а производство сои составляет около 17 млн ​​тонн. Таким образом, увеличение производства сои является серьезной проблемой, связанной с обеспечением средств к существованию людей.

Корневая гниль является одним из основных заболеваний сои (Ranathunge et al., 2008). Часто появляясь и нанося вред в течение всего цикла роста соевых бобов, это заболевание вызывает гниение семян до появления всходов, увядание растений после появления всходов, увядание и пожелтение листьев на стадии взрослых растений, а также вызывает гниение и задержку роста и т. д. (Dorrance, 2018). ).Согласно оценкам, ежегодно корневая гниль, вызываемая Phytophthora sojae , приносит экономический ущерб в размере более 1 миллиарда долларов США при производстве сои во всем мире (Kaufmann and Gerdemann, 1957). Определение того, как надежно предотвратить корневую гниль, всегда было широко обсуждаемым исследовательским вопросом. В частности, поскольку посевные площади сои в последние годы продолжали увеличиваться, исследования по этому вопросу быстро приобрели актуальность. Следовательно, в настоящем исследовании была принята новая точка зрения на изучение механизма устойчивости соевых бобов после заражения P.sojae , а также влияние соевых бобов на самих себя и P. sojae после инфицирования. Основная причина этого заключалась в том, что изучение долгосрочных стратегий контроля широкого спектра, подходящих для соевых бобов, имеет большое значение для увеличения производства сои и доходов.

С момента первого экспериментального открытия мРНК в 1993 году исследования мРНК достигли значительного прогресса, и исследователи постепенно посвятили себя исследованиям мРНК (Brodersen and Voinnet, 2006; Pertea et al., 2016; Ли и Ли, 2018). мРНК препятствует стандартной трансляции РНК за счет комплементарного спаривания оснований с мРНК и даже разрушает мРНК, вызывая ее молчание, тем самым влияя на уровень экспрессии белка в организмах и выполняя регулирующую функцию в росте и развитии организмов (Gottesman, 2005; Huang et al. , 2009; Attila et al., 2010; Aucher et al., 2013; Chen et al., 2020). В дополнение к ранее упомянутой регулирующей функции в самом организме, недавние исследования показали, что sRNA также может проникать в другие виды посредством киносъемки и других методов для поддержания активности и контроля жизненного процесса других видов (Deng et al., 2018). Например, Чжан и др. (2011) обнаружили, что miR168a в растительном рисе может проникать в организм животных при приеме внутрь и ингибировать стандартный процесс трансляции мРНК, которая транслирует белок LDLRAP1 в тканях печени животных, а также обеспечивать межвидовую регуляцию животных. Исследование Zhou et al. (2015) подтвердили, что микроРНК растений могут стабильно существовать в легких экспериментальных мышей и ингибировать саморепликацию вируса гриппа А.

В последние годы исследования показали, что мРНК может использоваться в качестве эффектора для передачи между взаимодействующими патогенными бактериями и растениями и может регулировать уровень экспрессии мРНК-мишени в соответствии с механизмом РНК-интерференции. Этот механизм называют механизмом межвидовой регуляции (Weiberg et al., 2015). Например, Arne W et al. в 2013 г. обнаружили, что когда Botrytis cinerea заражают томаты, высвобождаются молекулы sRNA, тем самым вторгаясь в помидоры, вызывая молчание генов, связанных с иммунитетом томата, и достигая ингибирующего эффекта на иммунный процесс растения-хозяина (Altuvia, 2007; Weiberg et al. ., 2013). Вайберг и др. (2015) экспериментально подтвердили, что рРНК B.cinerea может подавлять мРНК Arabidopsis , транслирующего белок AGO1, путем спаривания и связывания, тем самым влияя на нормальный иммунный ответ Arabidopsis . мРНК Arabidopsis также может передаваться патогену B. cinerea и ингибировать экспрессию связанных с патогенностью генов патогена B. cinerea , как было обнаружено Cai et al. (2018). Вышеупомянутое исследование предлагает новое направление и новые идеи для изучения болезней растений.

Отсутствуют сведения о построении моделей прогнозирования sRNA относительно устойчивости сои к инфекции P. sojae в сочетании с машинным обучением. Исследования возможности обратной регуляции P. sojae соей с уровня рРНК остаются в зачаточном состоянии, а анализ рРНК остается на стадии биологических экспериментов. Отсутствует отчет о методе анализа данных совмещения компьютерных методов исследования устойчивости растений к грибковому поражению.В настоящей статье в качестве основы для данных были приняты дифференциально экспрессируемые последовательности sRNA соевых бобов, инфицированных P. sojae . Построение модели предсказания sRNA для устойчивости сои к патогенности Phytophthora было сочтено важным для предсказания потенциала устойчивости к болезням неизвестной sRNA сои и ее sRNA из близкого источника. В то же время последовательности sRNA были соответственно нацелены на сою и Phytophthora и основаны на алгоритме PageRank для извлечения основных регуляторных модулей, анализа функции регуляторного пути, а затем проверки роли выбранного ключа устойчивости к болезням сои. Последовательность мкРНК в борьбе с болезнью Phytophthora .Настоящая статья является новаторской в ​​изучении возможных регулирующих эффектов сои на аутоиммунный ответ и P. sojae в sRNA. Между тем, настоящая статья обеспечивает базу данных для исследования механизма взаимодействия сои и P. sojae , теоретическую основу для увеличения урожая и дохода сои, а также план анализа данных для исследования взаимодействия других растительных грибов, имея жизненно важное научное значение.

Данные и методы

В соответствии с общедоступной базой данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) целью настоящей статьи было получение данных о РНК сои до и после заражения Phytophthora sojae , а также путем предварительной обработки, такой как удаление суставов, удаление -качество данных и стандартизация.После статистического анализа были получены данные о дифференциальной экспрессии мРНК сои до и после инфицирования штаммом P. sojae . Во-первых, путем нацеливания дифференциально экспрессируемой мРНК сои на данные мРНК сои и P. sojae , мРНК-мишень была проанализирована на предмет функционального обогащения, а также были проанализированы биологические процессы и функциональные пути, связанные с защитой пассивной и активной устойчивости сои к инфекции были обнаружены. Кроме того, при сравнении модели прогнозирования устойчивости сои с помощью sRNA с патогенностью Phytophthora , построенной с помощью трех методов машинного обучения, было обнаружено, что XGBoost оказывает лучший эффект.Общий процесс этой статьи показан на рисунке 1.

Рисунок 1 . Схема исследования механизма устойчивости сои.

Источник данных и предварительная обработка

Источники данных

В настоящей статье данные были получены от NCBI для образцов с теми же условиями культивирования, за исключением инфекции, а именно, sRNA сои, инфицированной P. sojae , и пустые образцы (GSM1370294) для соевых бобов, которые не были инфицированы P. sojae. .Данные включали данные генома P. sojae ( P. sojae V3.0), данные генома сои (Wm82.gnm1), данные мРНК P. sojae (W05.gnm1) и данные мРНК сои (Wm82. gnm1.ann1).

Лечение суставов

Поскольку данные, загружаемые в NCBI, имеют формат SRA, в настоящей статье были приняты инструменты sratoolkit.2.10.4 для преобразования в формат FASTQ. После преобразования была получена последовательность sRNA такой же длины. Для получения правильной фактической последовательности было необходимо удаление линкера.После консультации было обнаружено, что последовательность линкера представляет собой «TGGAATTCTCGGGTGCCAA». Чтобы получить достоверные данные без избыточной информации, Cutadapter использовали для удаления суставов экспериментальной группы соевых бобов, инфицированных P. sojae , и последовательности пустой группы, не зараженной P. sojae . Процесс совместной обработки показан на рисунке 2.

Рисунок 2 . Блок-схема предварительной обработки данных.

Информация о качестве и обработка длины

При анализе данных после удаления стыков можно сделать вывод, что исходные данные не подвергались обработке по длине, контролю качества и т. д.Конкретная длина и распределение порядковых номеров, соответствующие каждой длине, представлены на рисунках 3A, B. Учитывая ограничения инструментов, оборудования и трудности контроля условий во время биологических экспериментов, легко могут возникнуть определенные ошибки в данных. Чтобы обеспечить строгость эксперимента, в настоящей статье использовался FastQC для контроля качества последовательности. Здесь, по крайней мере, 80% оснований в каждой последовательности мРНК должны иметь значение качества, большее или равное 33.Диаграммы распределения длины, полученные после контроля качества, представлены на рисунках 3C,D. В настоящей статье предполагается, что длина последовательности рРНК, которая может быть нацелена на гены сои и генов P. sojae , должна составлять 18–25 н., сохраняются только последовательности рРНК длиной 18–25 н. После удаления суставов и удаления контроля низкого качества и длины статистические данные по экспрессии последовательностей были соответственно выполнены для данных sRNA сои пустой группы; и данные sRNA экспериментальной группы, инфицированные P.sojae , конкретный метод, представляли собой дедупликацию данных для получения типа последовательности, а номер каждой последовательности в файле статистических данных был уровнем экспрессии последовательности. Количественная статистика двух групп sRNA представлена ​​в таблице 1, где соя представляет собой пустую группу последовательности sRNA сои, а смешанные данные для инфицированных представляют собой последовательность sRNA экспериментальной группы после инфицирования.

Рисунок 3 . Результаты оценки последовательности FastQC. (A) Данные мкРНК контрольной группы соевых бобов без контроля качества. (B) Данные мРНК экспериментальной группы, инфицированной Phytophthora sojae , без контроля качества. Абсцисса на рисунке обозначает длину последовательности, а ордината указывает количество последовательностей. (C,D) Соответствующие результаты контроля качества. Ордината представляет количество последовательностей, а абсцисса обозначает среднее базовое качество последовательностей.

Таблица 1 . Статистика объема данных до и после контроля качества.

Сопоставление данных с геномом

Phytophthora sojae

Чтобы гарантировать, что данные sRNA относятся к сое, а не к P. sojae или загрязнителям, в настоящей статье последовательность sRNA, инфицированная P. sojae , картирована с геномом сои и сохранена совпадающая последовательность. Впоследствии полученная последовательность была картирована с геномом P. sojae с сохранением несовпадающих последовательностей. Здесь в настоящей статье используется инструмент для сопоставления коротких последовательностей с геномом Bowtie2-2. 3.4.1 и samtools-1.9, набор инструментов для управления SAM и BAM, для сопоставления последовательностей с геномом, как показано на рисунке 4. Конкретные шаги включали следующее: (1) создание базы данных на основе генома сои для получения пакета индексных файлов. для операций сопоставления; (2) сопоставление файла FASTQ с последовательностью мРНК, зараженной P. sojae , и файла fasta с последовательностью пустого образца с использованием инструмента «бабочка» для выполнения строгого сопоставления на основе индексного пакета первого шага, установка параметра несоответствия в 0 и сохраняя вывод всех результатов сравнения в файл SAM; (3) использование SAMtools для преобразования файлов SAM в файлы BAM; (4) устранение избыточности и сохранение совпадающих последовательностей; (5) преобразование файлов BAM в файлы FASTQ; и (6) повторение того же, что и выше, для создания библиотеки из P.sojae , выполняя описанную выше операцию над данными FASTQ, сохраненными в геноме сои, и сохраняя данные, не соответствующие геному сои Phytophthora .

Рисунок 4 . Дорожная карта для сопоставления данных с технологией генома.

Настоящая статья была написана на основе типа анализа последовательности малой РНК после заражения P. sojae . Согласно статистике, после удаления суставов, обработки информации о качестве и контроля длины, но еще без картирования, типов последовательностей было 1 251 487.В геноме сои было картировано 1 112 350 видов последовательностей малых РНК. Было 1 091 544 вида последовательностей малых РНК, которые картировались в геноме сои и не могли быть картированы в P. sojae . Как показано в Таблице 2, после этого шага можно было определить, что оставшиеся 1 091 544 мРНК принадлежат мРНК сои. В соответствии с данными о 1 091 544 видах sRNA изменения экспрессии до и после заражения были сравнены и проанализированы в настоящей статье, и был проведен скрининг дифференциально экспрессируемых sRNA.

Таблица 2 . Статистика объема данных до и после карты.

Стандартизация данных и множественный анализ различий

Из таблицы 1 можно сделать наблюдение, что общая экспрессия и типы мРНК заметно изменились до и после инфицирования. Таким образом, обычно используемая нормализация, стандартизация минимум-макс, преобразование логарифмической функции и преобразование анта-функции не подходили для стандартизации текущих данных. Здесь была проведена квартильная стандартизация уровней экспрессии до и после заражения, чтобы сделать их сопоставимыми.Путем сортировки всех последовательностей в порядке возрастания на основе уровня экспрессии и последующего выбора положения в три четверти в качестве контрольной точки уровень экспрессии был установлен равным 1, а уровни экспрессии других последовательностей были преобразованы в кратные уровню экспрессии в опорной точке. После этого шага уровни экспрессии всех последовательностей в образце были преобразованы во множественные отношения относительно уровня экспрессии контрольной точки образца. Этот метод позволяет избежать различий в базе, типе и количестве между разными образцами.

В настоящей статье сравниваются 1 091 544 последовательности sRNA, которые соответствуют геному P. sojae и не соответствуют геному P. sojae , с пустой группой. Было обнаружено, что 192 283 вида существовали в последовательности до и после заражения, и только 899 261 вид существовал в последовательности после заражения. Что касается 192 283 видов, появившихся до и после заражения, в настоящей статье предполагается, что после нормализации данных уровень экспрессии после заражения значительно выше, чем уровень экспрессии до заражения; то есть после многократного увеличения последовательность с более высоким уровнем экспрессии после заражения является положительным образцом, который является неотъемлемой частью механизма устойчивости сои.Конкретный метод расчета обозначен в уравнении. 1:

Скорость=количество(после)-количество(до)количество(до)    (1)

В настоящей статье положительные образцы были основаны как на скорости роста, так и на уровне экспрессии, а данные после заражения и картирования были подвергнуты скринингу. Первая часть представляет собой образец, общий для инфицированной группы и пустой группы, который соответствует скорости роста выше 10 и уровню экспрессии выше 200. Два условия привели к 732 последовательностям. Разница в уровнях экспрессии до и после заражения показана на рисунке 5.Абсцисса указывает индекс последовательности, который отсортирован в лексикографическом порядке, а ордината относится к уровню экспрессии. Из-за чрезмерной экспрессии отдельных положительных образцов рисунок 5 не является ясным и интуитивно понятным. Из рисунка можно сделать наблюдение, что количество экспрессии большинства последовательностей было менее 2000. Следовательно, рисунок 6 был построен с уровнем экспрессии 2000 в качестве верхнего предела, где уровень экспрессии одной и той же последовательности существенно отличался до и после заражения.Вторая часть представляет собой вновь сгенерированную последовательность в группе заражения, при этом пустая группа не имеет соответствующей последовательности. Здесь было отобрано 36 последовательностей с уровнями экспрессии выше 100, и всего 768 последовательностей были использованы в качестве положительных образцов.

Рисунок 5 . Семьсот тридцать два изменения выражения лица до и после заражения.

Рисунок 6 . Изменения уровня экспрессии (верхний предел 2000) до и после заражения.

Предсказание целевого гена

Основанный на 768 последовательностях, выбранных выше, чтобы найти биологические процессы и регуляторные пути, связанные с механизмом устойчивости сои, гены-мишени сои и P.sojae были соответственно предсказаны. На данный момент Tapir-1.2 был применен в настоящей статье для прогнозирования. Сначала файл был преобразован в формат FASTA, а все основания T заменены на основания U, а затем выполнено целевое предсказание по данным мРНК сои и P. sojae соответственно, с использованием параметров инструмента Tapir по умолчанию. , а именно, mimic = 0, score ≤ 4, mfe_ratio ≥ 0,7. Результаты предсказания целевого гена были подсчитаны после запуска на сервере, и результаты показали, что в общей сложности 2979 типов мРНК сои и 1683 типа P.мРНК sojae может быть нацелена.

Выберите основной узел, предназначенный для самой сои

В настоящей статье база данных String и база данных SoyBase были приняты для анализа регуляторного пути KEGG_Pathway и анализа обогащения функции GO(BP). Из-за большого количества результатов предсказания целей для сои очевидные пути обогащения не были ясными и интуитивно понятными. PageRank — это метод, используемый Google для определения рейтинга/важности веб-страницы, и единственный стандарт, используемый Google для измерения качества веб-сайта.Алгоритм преимущественно основан на двух предположениях: во-первых, если на узел указывает много узлов, этот узел считается более важным; и во-вторых, если значение самого узла относительно велико, узел, на который указывает узел, считается более важным. Сеть обогащения функционального пути имеет аналогичные функции. Если на функциональном пути имеется больше узлов, указывающих на определенный узел, этот узел часто является основной управляющей функцией. Параллельно, общая функциональность узла, на который указывает важный узел, также сильнее.Поэтому в настоящей статье алгоритм PageRank использовался для проверки кластеров основных функций. Конкретный метод расчета обозначен в уравнении. 2:

PRa=∑b=B1BaPRbLb    (2)

Среди них PR(a) относится к значению PageRank узла u, B(a) обозначает набор входящих ссылок всех a, а L(b) указывает степень всех исходящих ссылок узла v указывая на узел.

Сеть, основанная на кластерах основных функций, была снова проанализирована для дальнейшего выбора наиболее важных функций.Диаграмма нормативной сети основного функционального кластера для выбранных 50 узлов показана на рисунке 7.

Рисунок 7 . Основные узлы, ориентированные на соевые бобы, проверены алгоритмом PageRank. Здесь был выбран тип доверительной линии, где узлы на рисунке представляют белки, предназначенные для соевых бобов, а связи между узлами представляют отношения взаимодействия между белками. Толщина указывает на силу взаимодействия между белками.

Предиктивное построение модели

Отбор отрицательного образца

Всего 768 дифференциально экспрессируемых последовательностей мРНК в 2.2 были выбраны в качестве положительных образцов в настоящей статье. Затем были проведены расчеты на пересечении пустой группы данных по сое и данных экспериментальной группы, зараженных P. sojae , для получения сосуществующих данных. Последовательности со скоростью роста 1 до и после заражения отбирали из данных, а затем в качестве отрицательных образцов случайным образом отбирали такое же количество последовательностей мРНК, что и положительные образцы. Сравнительная таблица экспрессии положительного и отрицательного образца показана на рисунке 8, где абсцисса представляет индекс последовательности, отсортированный в порядке словаря, а ордината означает экспрессию последовательности.Поскольку экспрессия отдельных положительных образцов была слишком большой, изображение было размытым, но можно заметить, что экспрессия узлов на графике в основном была ниже 2000. По этой причине рисунок 9 был нарисован в том виде, в котором он представлен. Можно сделать еще одно наблюдение: разница между положительными и отрицательными образцами была значительной, но отрицательный образец все еще был недостаточно четким; таким образом, карта экспрессии отрицательного образца была нарисована, как показано на рисунке 10.

Рисунок 8 .Сравнение положительных и отрицательных уровней экспрессии образца.

Рисунок 9 . Сравнительная таблица положительного и отрицательного образцов экспрессии (верхний предел 2000).

Рисунок 10 . Отображение отрицательного выражения образца.

Извлечение признаков

В соответствии с проверенными признаками и анализом текущей последовательности в настоящей статье предложено в общей сложности 114 признаков, включая признаки последовательности (длина последовательности и локальное основание) и структурные признаки [% гуанина-цитозина (GC), частота мотива (1–3 nt) и минимальной свободной энергии (MFE)]. Что касается локального основания и 3′-концевого двойного основания и 5′-концевого двойного основания, значения были A, G, C, U и N. Если длина была менее 25 нуклеотидов, N использовался для замены в дополнение к тот. Поскольку функции, необходимые для машинного обучения, были цифровыми, для этих функций последовательности выполнялось однократное кодирование. Конкретная форма кодирования представлена ​​в таблице 3. Для получения MFE был использован инструмент RNAfold. Информация о выборе конкретных функций, количество каждой функции, количество функций после горячего кодирования и общее количество функций перечислены в таблице 4.Эти 203 функции были использованы для последующих операций.

Таблица 3 . Коды, соответствующие базам.

Таблица 4 . Функции, выбранные моделью прогнозирования.

Локальная база: используется для указания типа базы в позициях с 1 по 25 в последовательности. Длина последовательности менее 25 н. , а недостающая часть заполнена N. Длина последовательности: указывает длину мкРНК; здесь он относится к 18–25 н. GC%: отношение количества вхождений «G (гуанин)» и «C (цитозин)» в последовательности к общей длине последовательности.Содержание GC оказывает существенное влияние на стабильность и структуру мРНК. MFE: MFE sRNA является важной мерой ее структурной стабильности. В этой статье MFE получен с помощью инструмента RNAfold. В нормальных условиях этот индикатор может измерять вероятность взаимодействия между РНК и может использоваться в качестве стандарта для различения всех кодирующих и некодирующих РНК. Двойное основание на 5′-конце, двойное основание на 3′-конце: поскольку транскрипция ДНК и трансляция РНК имеют определенную последовательность и направленность, первые два основания на 3′-конце и 5′-конце используются для обозначения начала различных процессов. .Мотив (1–3 нуклеотида): небольшие фрагменты последовательности со специфическими функциями, которые неоднократно появляются в последовательности. Количество их появлений может играть определенную роль в определении общей характеристической функции последовательности. Среди них 1 nt имеет четыре признака, 2 nt имеет 16 признаков, а 3 nt имеет 64 признака.

После того, как выбор признаков был завершен, признаки с низкой дисперсией были удалены, а затем был выполнен последующий выбор модели и обучение. Это было связано с тем, что в упомянутых выше функциях могли быть избыточные функции, которые могли повлиять на эффект предсказания классификатора.

Алгоритм выбора модели

Основываясь на характеристиках sRNA, построение прогностической модели дифференциально экспрессируемой sRNA сои может снизить стоимость экспериментальных исследований. Поскольку эта статья представляет собой модель прогнозирования, созданную для многомерных задач бинарной классификации с малой выборкой, и не предъявляет слишком много требований к временной и пространственной сложности, три модели машинного обучения, которые представляют собой машины опорных векторов (SVM), случайные леса и XGBoost используются для решения проблем классификации.

SVM — это метод бинарной классификации, основанный на обучении с учителем в машинном обучении. Он называется оптимальным классификатором ребер. Он имеет хорошую производительность обучения и имеет хорошую производительность в классификации многомерных данных. Эффект состоит в том, что это не легко переобучить. Он может эффективно классифицировать выборки с небольшими объемами данных, избежать проблемы выбора структуры нейронной сети и точек локального минимума и получил широкое распространение.

Случайный лес — это алгоритм обучения с учителем, наиболее представительный из ансамблевых алгоритмов, демонстрирующий удивительную производительность в классификации и регрессии.Основная идея алгоритма состоит в построении нескольких деревьев решений слабого классификатора путем случайного извлечения выборок и признаков. Только когда более половины базовых классификаторов совершают ошибки, они делают неверные прогнозы. Он может обрабатывать многомерные данные без выбора признаков (поскольку подмножество признаков выбирается случайным образом). Из-за случайной выборки обученная модель имеет небольшую дисперсию и сильную способность к обобщению, и ее нелегко переобучить.

XGBoost — это масштабируемая система машинного обучения для повышения дерева.Система получила широкое признание в большом количестве задач машинного обучения и интеллектуального анализа данных благодаря своей выдающейся эффективности и высокой точности прогнозирования. Алгоритм XGBoost реализует генерацию слабого обучаемого за счет оптимизации структурированной функции потерь (добавлена ​​функция потерь регулярного члена, что может снизить риск переобучения), а алгоритм XGBoost не использует метод поиска, а напрямую использует функция потерь и производные первого и второго порядка, а также предварительная сортировка, взвешенный квантиль и другие методы для значительного повышения производительности алгоритма.

Деление выборки набора данных и стандартизация

Как упоминалось в разделе «Отбор отрицательных проб» , было 1536 положительных и отрицательных проб. В настоящей статье обучающая выборка и проверочная выборка были построены в соотношении 3:1. Затем данные обучающего набора использовались для обучения модели и настройки параметров, а данные проверочного набора применялись для оценки окончательной обученной модели.

Чтобы обеспечить одинаковое влияние всех функций на модель, набор данных необходимо было стандартизировать после извлечения функций, а затем стандартизированный набор данных использовался для обучения модели.Поскольку модель настоящей статьи должна была использовать расстояние для измерения сходства, а данные отдельных признаков имеют выбросы, метод стандартизации Z_Score был принят для обработки 203 наборов данных признаков. Конкретный метод расчета, как показано в уравнении. 3:

Featurenew=Feature-μσ    (3)

, где μ — среднее значение всех выборочных данных, σ — стандартное отклонение всех выборочных данных, Featurenew — стандартизированный набор данных, а Feature — предварительно стандартизированный набор данных.

Перекрестная проверка модели для выбора оптимальных параметров

Вышеупомянутый разделенный набор данных был использован для построения модели бинарной классификации с использованием трех методов: случайный лес, SVM и XGBoost.Модели были настроены на оптимальные параметры путем перекрестной проверки, чтобы каждая модель имела наилучший эффект. Для двух классификаторов показатели оценки в основном включали точность, полноту, точность и значение F1. Показатель точности использовался для расчета отношения правильно классифицированных выборок в классификаторе к общему количеству выборок. Конкретный метод расчета показан в уравнении. 4:

Точность=TP+TNTP+TN+FP+FN    (4)

Оценка модели алгоритма исключительно по точности далека от научной и исчерпывающей.В нормальных условиях коэффициент точности, полнота и значение F1 могут лучше предсказывать проблемы перекоса. Точность относится к доле правильных предсказаний, которые являются положительными, ко всем положительным предсказаниям, а полнота обозначает долю правильных предсказаний, которые являются положительными, ко всем положительным фактическим значениям. Значение F1 оценивается путем вычисления среднего гармонического значения точности и полноты. Методы расчета точности, полноты и значения F1 представлены в уравнениях. 5–7:

Точность=TPTP+FP    (5) Отзыв=TPTP+FN    (6) F1=2PRP+R=2TP2TP+FP+FN    (7)

В настоящей статье TP означает количество правильно классифицированных положительных образцов, TN означает количество правильно классифицированных отрицательных образцов, FN означает количество положительных образцов, классифицированных как отрицательные, а FP — количество отрицательных образцов, классифицированных как положительные. образцы.

Поскольку отклонения набора данных в настоящей статье уже обсуждались в разделе Извлечение признаков , точность была принята в качестве основного индекса оценки, а полнота, точность и F1 были вспомогательными индексами оценки. Затем были соответственно выбраны параметры трех моделей. Поскольку необходимо определить множество параметров, в настоящей статье для определения оптимальных параметров использовался поиск по сетке в сочетании с перекрестной проверкой. В процессе обучения SVM функция ядра внутреннего продукта может использоваться для замены нелинейного отображения в многомерное пространство.Окончательное решение определялось лишь небольшим количеством опорных векторов. Их общая сложность зависела от количества опорных векторов и не была чувствительна к аномальным данным. Следовательно, выбор числа опорных векторов был интегральным в общем эффекте модели, а гамма-параметр был параметром функции ядра радиальной базисной функции (РБФ), а его удельное значение было обратно пропорционально количеству опорные векторы. Таким образом, в настоящей статье в первую очередь определяются гамма и допустимая погрешность модели C.

Несколько базовых обучающихся совместно определили результаты случайного леса и XGBoost, и два параметра n_estimators и max_depth оказали большее влияние на эффекты этих двух моделей. n_estimators относится к максимальному количеству базовых учеников, которые необходимо разделить, и необходим компромисс для выбора оптимального количества базовых учеников. Это связано с тем, что обычно по мере увеличения числа базовых учащихся частота ошибок модели будет постепенно сходиться, но сложность кода будет постепенно увеличиваться.max_depth обозначает максимальную глубину дерева решений, где, как правило, чем больше глубина дерева, тем лучше соответствие. Тем не менее, переоснащение является обычным явлением. Настоящая статья включала большое количество признаков, и выбор этого значения необходимо было учитывать. Кроме того, случайный лес также выбирает параметр max_features, который указывает максимальное количество признаков, учитываемых при случайном выборе признаков, и эквивалентен дереву решений, когда равно количеству признаков.XGBoost также выбирает параметр гаммы и параметр подвыборки. Параметр gamma указывает минимальное падение функции потерь, необходимое для разделения узла. Чем больше значение этого параметра, тем более консервативен алгоритм. Параметр подвыборки управляет коэффициентом случайной выборки каждого дерева и не отменяет выборку. Уменьшите значение этого параметра, и алгоритм станет более консервативным и позволит избежать переобучения. Однако, если это значение установлено слишком маленьким, это может привести к недостаточной подгонке.

Конкретный процесс поиска оптимальных параметров по сетке заключался в следующем: (1) выбор 1152 последовательностей тестового набора в качестве выборки для оптимизации параметров; 2) определение диапазона значений основных оптимизируемых параметров. Для SVM C составлял 0,001–100, а гамма — 0,001–100; для случайного леса n_estimators составляло 1–102, max_depth — 3–14, а max_features — 3–11. Для XGBoost n_estimators составляло 10–100, max_depth — 2–14, подвыборка — (0, 1) и гамма — 0–100. (3) Для каждой модели выбирают различные значения параметров для комбинации, конкретный процесс использует точность в качестве показателя измерения, использует тройную перекрестную проверку для обучения и оценки и записывает параметр, соответствующий максимальному баллу.(4) Повторение операций (2) и (3) выше и выбор оптимальных параметров, соответствующих каждой модели.

Оптимальные параметры, определенные поиском по сетке, были следующими: для SVM после выбора функции ядра RBF оптимальные параметры составили 0,25 для C и 0,01 для gamma; для алгоритма случайного леса оптимальными параметрами были 91 для количества базовых учеников, 6 для максимальной глубины и 5 для максимального количества признаков; для алгоритма XGBoost оптимальными параметрами были 90 для количества базовых учеников, 2 для максимальной глубины, 0.7 для подвыборки и 0,001 для гаммы.

Результаты

Анализ функционального обогащения узлов-мишеней мРНК сои

Функциональный анализ обогащения самой сои

В настоящей статье эти 50 основных узлов в разделе Выберите основной узел, предназначенный для самой сои были снова импортированы в базу данных String, и результаты показывают, что общее обогащение белково-белкового взаимодействия (PPI) p — значение регуляторной сети равно 1.96д-10. Среди них значение p для 12 KEGG_Pathway было меньше порога достоверности 0,05, как показано в таблице 5. Регуляторные пути, показанные в таблице, были отсортированы в соответствии с достоверностью. В дополнение к правдоподобию можно сделать наблюдение, что чем больше число генов в пути, тем значительнее эффект пути.

Таблица 5 . KEGG_Путь сои к сопротивлению мРНК инфекции Phytophthora , нацеленной на мРНК сои.

Роль сои после заражения Phytophthora sojae можно в основном разделить на три категории: регулирование уровня ее метаболизма для противодействия инфекции Phytophthora , регуляция процесса продукции рРНК и изменение проницаемости мембраны. Среди вышеупомянутых регуляторных путей пути более высокого ранга включали взаимодействие растений и патогенов (коэффициент ложного обнаружения составлял 0,00014), путь наблюдения за мРНК (коэффициент ложного обнаружения составлял 0,00014).00033) и процессинг белка в эндоплазматическом (коэффициент ложного обнаружения составил 0,0012). Это указывает на то, что sRNA сои действительно может непосредственно противостоять инфекции P. sojae . Кроме того, метаболизм фосфоинозитидов и сигнальная система фосфатидилинозитола с коэффициентом ложного обнаружения 0,0126 могут изменять проницаемость клеточных мембран, оказывая решающее влияние на связывание P. sojae с клеточной мембраной сои для высвобождения рРНК в клетку сои.

Для дальнейшего изучения специфической биологической функции сои для саморегуляции биологическая функция ГО была проанализирована в настоящей статье на основе зрелых файлов аннотаций.Поскольку цель для предсказания целевого гена не соответствовала версии мРНК в SoyBase, файл аннотации (Glyma_11_to_Glyma_20_Correspondence_Full), предоставленный SoyBase, был сначала использован для преобразования версии мРНК, а затем был выполнен анализ обогащения GO(BP). Результаты показывают, что было 18 p -значений меньше достоверного порога 0,05, как показано в таблице 6.

Таблица 6 . Резистентность сои к инфекции Phytophthora , нацеленная на обогащение соевых бобов GO.

Из таблицы 6 можно сделать выводы о регуляции транскрипции, ДНК-зависимой (частота ложных открытий составила 4,18E-07), специфичной к последовательности ДНК-связывающей активности фактора транскрипции (частота ложных открытий составила 3,74E-06), факторе трансляции активность, связывание нуклеиновых кислот (коэффициент ложного обнаружения составил 0,001187864), активность АТФ-зависимой РНК-хеликазы (коэффициент ложного обнаружения составил 0,04021511), активность лигазы и образование аминоацил-тРНК и родственных соединений (коэффициент ложного обнаружения составил 0.04668625). Эти пять процессов были прямо или косвенно связаны с транскрипцией и трансляцией мРНК. Что касается процессов метаболического процесса ДНК (частота ложных открытий 0,001424074), мейоза (частота ложных открытий 0,004201701), перехода G2/M митотического клеточного цикла (частота ложных открытий 0,0119566168) и положительной регуляции сцепления сестринских хроматид ( частота ложных открытий составила 0,0119566168), они были напрямую связаны с метаболизмом сои, активностью 1-фосфатидилинозитол-4-киназы (коэффициент ложных обнаружений был равен 0,0119566168). 000563865) и опосредованная фосфатидилинозитолом передача сигналов (частота ложных открытий составила 0,040720139), которые, в свою очередь, были непосредственно связаны с проницаемостью мембраны. Приведенные выше результаты показывают, что эти ключевые мРНК могут непосредственно участвовать и регулировать уровень метаболизма соевых бобов, чтобы противостоять патогенности P. sojae , и могут регулировать путь заражения Phytophthora путем изменения проницаемости мембраны.

Анализ функционального обогащения целевого

Phytophthora sojae

Для дальнейшего изучения регуляторных эффектов дифференциальной экспрессии соевой РНК сои на P.sojae , 1683 мРНК P. sojae , полученные в этой статье, были сначала преобразованы в формат, распознаваемый базой данных String, в соответствии с файлом преобразования аннотаций String (67,593.protein.aliases.v11.0). Впоследствии преобразованный файл последовательности был импортирован в базу данных String, и полученное общее обогащение PPI сети p составило 1,0e-16. Среди них значение p для 11 KEGG_Pathway было меньше достоверного порогового значения 0,05, как показано в таблице 7.

Таблица 7 . Устойчивость сои к мРНК заражения Phytophthora , нацеленная на Phytophthora sojae KEGG_Pathway.

Как видно из Таблицы 7, ключевая устойчивая к заболеваниям мРНК сои может участвовать и регулировать различные пути регуляции P. sojae , в основном включая P. sojae трансмембранный транспорт, вырезание нуклеотидов, репарацию и процессы транспортировки. Было обнаружено, что дифференциально экспрессируемые sRNA могут обладать регуляторной функцией в трансмембранном транспорте и осуществлять нормальные функции P.соджа . В частности, путями, непосредственно связанными с проникновением мРНК сои в клетки P. sojae через трансмембранный транспорт, были метаболизм инозитолфосфата (ложная частота обнаружения 0,0236), сигнальная система фосфатидилинозитола (ложная частота обнаружения 0,0236), метаболизм глицеролипида (ложная частота обнаружения 0,0236). частота обнаружения составила 0,0489) и эндоцитоз (частота ложных открытий составила 0,0489). Пути, которые ингибируют функцию мРНК посредством расщепления и деградации соевой РНК сои, включают транспорт РНК (коэффициент ложного обнаружения равен 0.00033), эксцизионная репарация нуклеотидов (коэффициент ложного обнаружения составлял 0,0067), деградация РНК (коэффициент ложного обнаружения составлял 0,0236) и фагосома (коэффициент ложного обнаружения составлял 0,0358). В соответствии с вышеприведенным анализом на основе данных можно сделать вывод о том, что ключевая устойчивая к болезням мРНК сои может полностью регулировать проницаемость мембраны P. sojae и, таким образом, обеспечивать среду для проникновения в мембрану P. sojae сои. активная реверсивная инфекция. Можно сделать еще одно наблюдение, что ключевая sРНК сои, устойчивая к болезням, может полностью регулировать проницаемость P.sojae и создать среду для активного обратного инфицирования P. sojae . С другой стороны, ключевая мРНК устойчивости сои к болезням может полностью повлиять на патогенность P. sojae путем удаления и деградации мРНК P. sojae .

Резюме функционального анализа обогащения

Результаты показывают, что дифференциально экспрессируемая sРНК сои может регулировать метаболизм сои, лигазу, активность фактора трансляции, трансмембранный транспорт и другие биологические процессы, связанные с устойчивостью к болезням.Кроме того, указанная мРНК может регулировать процессы эндоцитоза P. sojae , расщепления и трансляции мРНК и трансмембранного транспорта. Эти процессы являются центральными процессами трансграничной регуляции sRNA сои P. sojae . В этой главе подтверждается, что выбранные 768 дифференциально экспрессируемых мкРНК являются ключевыми мкРНК для устойчивости сои к болезням.

Сравнение и анализ моделей на основе оптимизированных параметров

В духе сравнения эффектов классификации трех вышеуказанных моделей была проведена 5-кратная перекрестная проверка на обучающем наборе для моделей с выбранными оптимальными параметрами, и были рассчитаны статистические данные о точности, полноте, воспроизводимости и значении F1. из них, как показано на Фигуре 11.

Рисунок 11 . Три оценки модели.

Желтая, синяя и зеленая линии в правом верхнем углу рисунка выше соответствуют случайному лесу, SVM и XGBoost соответственно. Четыре подграфа соответственно представляют точность, полноту, точность и значение F1 вышеуказанного алгоритма для пяти перекрестных проверок на обучающем наборе. Как видно из рисунка выше, XGBoost и SVM показали хорошие результаты во всех аспектах.

Причина в том, что на основе опорных векторов SVM может избежать сложности многомерного пространства и может эффективно классифицировать небольшие выборки данных.Для этого набора данных подходит как количество выборок, так и количество признаков выборки. Недостатком является то, что он не эффективен для задач с несколькими классификациями и больших выборочных данных, но данные в этой статье представляют собой небольшие выборочные данные и проблему с двумя классификациями. Случайный лес строит несколько деревьев решений классификатора, случайным образом извлекая образцы и признаки. Только когда более половины базовых классификаторов имеют ошибки, они будут делать неверные прогнозы и хорошо обрабатывать многомерные данные.Недостатком является то, что он будет соответствовать некоторым зашумленным задачам классификации или регрессии, но данные в этой статье не соответствуют этому. Это может не дать хорошей классификации для небольших данных или данных низкой размерности (данных с меньшим количеством функций). Поскольку эта статья представляет собой небольшую выборку данных, эффект будет относительно плохим. XGBoost использует параллельную оптимизацию для детализации признаков, добавляет член регуляризации к целевой функции для предотвращения переобучения и использует преимущества выборки опорных столбцов случайного леса, которая не только снижает переоснащение, но и снижает сложность вычислений.В то же время XGBoost может выполнять следующий итерационный процесс после завершения одной итерации; то есть последующий процесс итерации содержит предсказанное значение предыдущего процесса итерации, поэтому он имеет лучший эффект классификации для набора данных этой статьи. Недостатком является то, что сложность процесса предварительной сортировки слишком высока, а скорость выполнения ниже, чем у случайного леса (мешков), но в этой статье не слишком много требований для этого.

Площадь рабочей характеристики приемника под кривой (ROC-AUC) была принята для дальнейшей оценки модели.Кривая ROC использовала частоту истинно положительных результатов (TPR) в качестве ординаты и частоту ложноположительных результатов (FPR) в качестве оси абсцисс. TPR — это скорость отзыва, упомянутая выше. Метод расчета FPR показан в уравнении. 8:

С точки зрения кривой ROC точка (0, 1) в верхнем левом углу, то есть точка, где FPR был равен 0, а TPR был равен 1, указывает, что FN был равен 0, а FP был равен 1, подразумевая, что все образцы были правильно классифицированы. Точка (0, 0) в левом нижнем углу, в частности, точка, где FPR был равен 0, а TPR был равен 0, означает, что FP был равен 0, а TP был равен 0, что указывает на то, что классификатор предсказал все выборки как отрицательные выборки. Параллельно точка (1, 1) в правом верхнем углу показывает, что классификатор предсказал все выборки как положительные выборки. Точка (1, 0) в правом нижнем углу, то есть точка, где FPR был равен 1, а TPR был равен 0, означает, что классификатор неправильно классифицировал все выборки, то есть предсказал все положительные выборки как отрицательные выборки и предсказал все отрицательные образцы как положительные образцы. На диагонали FP = TN и TP = FN, т. е. случайная классификация. То есть, чем ближе общий тренд был к точке (0, 1), тем выше эффект модели.Во многих случаях кривая ROC четко не указывает, какой классификатор работает лучше. По этой причине для более точного сравнения моделей в качестве критерия оценки использовалась площадь под ROC-кривой и ось координат, другими словами, AUC. На рис. 12 показаны кривые ROC для проверки и оценки моделей случайного леса, SVM и XGBoost с использованием данных 384 проверочных наборов.

Рисунок 12 . Кривые рабочих характеристик приемника (ROC) трех моделей.

Из приведенного выше рисунка можно сделать вывод, что площади под кривыми трех моделей машинного обучения были относительно большими, кривые в целом были относительно гладкими и не возникало явления переобучения. В настоящей статье XGBoost с самым высоким значением AUC был выбран в качестве окончательного классификатора. Между тем, классификатор также показал хорошие результаты с точки зрения точности и полноты. Его точность на проверочном наборе составила 86,98%, а значение AUC — 0,9465. В тренировочном наборе значение AUC было равно 0.9805, подразумевая, что общий эффект модели был лучше. Следовательно, модель может также предсказывать дифференциальную экспрессию sRNA P. sojae , картированную в геноме P. sojae после заражения, и имеет эталонное значение для отбора дифференциально экспрессируемых sRNAs в растениях, инфицированных другими типами грибов.

Обсуждение

Ограничения предсказания целевого гена

Что касается дифференциально экспрессируемых мРНК, из-за длительного времени работы только TAPIR использовался в качестве инструмента для предсказания их генов-мишеней, после чего непосредственно выполнялся анализ функционального обогащения этих генов-мишеней. Для инструментов генов-мишеней, связанных с растениями, чаще используются psRNATarget и TAPIR. Что касается другого программного обеспечения для предсказания целевого гена, алгоритмы в нем другие. В настоящей статье был принят только TAPIR, а это означает, что полученные результаты могут быть неполными. Лучший эффект предсказания может быть получен, если используется разнообразное связанное программное обеспечение.

Откройте для себя значение биологических процессов и путей регуляции

Настоящее исследование показало, что дифференциально экспрессируемые мкРНК сои могут регулировать многочисленные устойчивые к болезням и связанные с ростом биологические процессы самой сои, а также основные процессы многих Phytophthora sojae .Настоящее исследование заложило основу для способности других растений противостоять грибковой инфекции. Кроме того, когда различные растения устойчивы к грибковой инфекции, существуют определенные сходства между биологическими процессами и их регуляторными путями, которые заслуживают обсуждения и исследования. Если связь между этими процессами может быть обнаружена, это обеспечит важную теоретическую основу и новые идеи контроля для борьбы с болезнями растений.

Модель Универсальность

XGBoost был выбран в качестве окончательного классификатора в настоящей статье, который имеет хороший прогностический эффект для прогнозирования корреляции между неизвестной последовательностью sRNA сои и устойчивостью к P.инфекция sojae . Это обеспечивает теоретическое руководство для проведения биологических экспериментов и снижает затраты на эксперименты. Как бы то ни было, применима ли эта модель к другим растениям и анализу устойчивости грибов на основе мРНК, остается неясным и требует дальнейшего изучения. При наличии достаточного количества данных ключевые sRNAs для противогрибковых заболеваний растений могут быть предсказаны на основе анализа данных и методов построения модели, предложенных в настоящей статье для проверки универсальности модели.

Применение моделей машинного обучения

В настоящей статье использовались только случайный лес, SVM и XGBoost, которые представляют собой три метода построения модели предсказания sRNA для устойчивости сои к патогенности Phytophthora . В машинном обучении существует множество моделей, которые также могут классифицировать выборки, используя больше моделей, которые потенциально могут дать лучшие результаты прогнозирования.

Заявление о доступности данных

Оригинальные вклады, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительный материал, дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору.

Вклад авторов

LD и YL задумали и руководили проектом. JC и SS получили исходные данные и интерпретировали их. LD, JC, SS, HaZ и HeZ провели анализ данных и интерпретировали результаты. JC и SS помогли разработать исследование и проанализировали данные. LD, JC и HaZ написали и/или отредактировали рукопись. Все авторы подготовили и рецензировали рукопись и одобрили ее к публикации.

Финансирование

Это исследование финансировалось Комиссией по проекту развития и реформ провинции Цзилинь (номер .2019C053-6).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сноски

Каталожные номера

Аттила М., Чарльз М., Эндрю Б., Томас Дж. Х., Рут Д. и Дэвид С. Б. (2010). Малые сайленсинговые РНК в растениях мобильны и направляют эпигенетическую модификацию в клетки-реципиенты. Наука 328, 872–875.doi: 10.1126/science.1187959

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Aucher, A., Rudnicka, D., и Davis, D.M.J.J.O.I. (2013). МикроРНК переносятся из макрофагов человека в клетки гепатокарциномы и ингибируют пролиферацию. Дж. Иммунол. 191, 6250–6260. doi: 10.4049/jimmunol.1301728

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Cai, Q., Qiao, L., Wang, M., He, B., Lin, F.M., Palmquist, J., et al. (2018).Растения посылают малые РНК во внеклеточных везикулах грибковому патогену, чтобы заглушить гены вирулентности. Наука 360, 1126–1129. doi: 10.1126/science.aar4142

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен Дж. , Хань Г., Сюй А. и Цай Х. (2020). Идентификация многомерных регулирующих модулей посредством сопоставления нескольких графов с сетевыми ограничениями. IEEE Trans. Биомед. англ. 67, 987–998. doi: 10.1109/TBME.2019.2927157

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дэн, Ю., Ван, Дж., Тунг, Дж., Лю, Д., и Ли, Ф. Дж. П. П. (2018). Роль малых РНК в регуляции врожденного иммунитета в процессе роста растений. PLoS Патог. 14:e1006756. doi: 10.1371/journal.ppat.1006756

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Дорранс, AEJCJOPPP (2018). Управление Phytophthora sojae сои: обзор и перспективы на будущее. Кан. Дж. Плант Патол. 40, 210–219. дои: 10.1080/07060661.2018.1445127

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Хуанг, Х.Y., Chang, H.Y., Chou, C.H., Tseng, C.P., Ho, S.Y., Yang, C.D., et al. (2009). sRNAMap: геномные карты малых некодирующих РНК, их регуляторов и их мишеней в микробных геномах. Рез. нуклеиновых кислот. 37, Д150–Д154. doi: 10.1093/nar/gkn852

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кауфманн, М. Дж., и Гердеманн, Дж. В. Дж. П. (1957). Корневая и стеблевая гнили сои, вызываемые Phytophthora sojae n. сп. Фитопатология 48, 201–208.

Академия Google

Пертеа М., Ким Д., Пертеа Г. М., Лик Дж. Т. и Зальцберг С. Л. Дж. Н. П. (2016). Анализ экспрессии на уровне транскрипта в экспериментах RNA-seq с HISAT, StringTie и Ballgown. Нац. протокол 11, 1650–1667. doi: 10.1038/nprot.2016.095

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ranathunge, K., Thomas, R.H., Fang, X., Peterson, C.A., and Bernards, M.A.J.P. (2008). Суберин корня сои и частичная устойчивость к корневой гнили, вызванной Phytophthora sojae . Фитопатология 98, 1179–1189. doi: 10.1094/PHYTO-98-11-1179

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Вейберг А. , Ван М., Лин Ф. М., Чжао Х., Чжан З., Калошян И. и др. (2013). Малые РНК грибов подавляют иммунитет растений, перехватывая пути интерференции РНК-хозяина. Наука 342, 118–123. doi: 10.1126/science.1239705

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжан Л., Хоу Д., Чен С., Li, D., and Zhang, CY JCR (2011). Экзогенное растение MIR168a специфически нацелено на LDLRAP1 млекопитающих: свидетельство межцарственной регуляции с помощью микроРНК. Сотовые Res. 22, 107–126. doi: 10.1038/cr.2011.158

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Zhou, Z., Li, X., Liu, J., Dong, L., Chen, Q., Liu, J., et al. (2015). Атипичная микроРНК 2911, кодируемая жимолостью, непосредственно нацелена на вирусы гриппа А. Сотовые Res. 25, 39–49. дои: 10.1038/кр.2014.130

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Использование пиросеквенирования родоспецифического ампликона для оценки видового разнообразия Phytophthora с использованием эДНК из почвы и воды в Северной Испании

Abstract

Phytophthora – один из наиболее важных и агрессивных родов патогенов растений в сельском и лесном хозяйстве. Раннее обнаружение и выявление путей заражения и распространения имеют большое значение для минимизации угрозы, которую они представляют для природных экосистем.эДНК была извлечена из почвы и воды лесов и плантаций на севере Испании. Праймеры, специфичные для Phytophthora , были адаптированы для использования в высокопроизводительном секвенировании (HTS). Праймеры были протестированы в контрольной реакции, содержащей восемь видов Phytophthora , и были нанесены на образцы эДНК воды и почвы из северной Испании. Для оптимального разделения видов Phytophthora были протестированы различные пороговые значения охвата баллов в специально созданной базе данных и в контрольной реакции.Кластеризация на уровне 99% была оптимальным критерием для разделения большинства из видов Phytophthora . В образцах окружающей среды были амплифицированы множественные молекулярные операционные таксономические единицы (MOTU), соответствующие 36 различным видам Phytophthora . Пиросеквенирование ампликонов из почвенных образцов выявило низкое разнообразие Phytophthora (13 видов) по сравнению с 35 видами, выявленными в пробах воды. Тринадцать из MOTU, обнаруженных в реках и ручьях, не показали близкого совпадения с последовательностями в международных базах данных последовательностей, показывая, что пиросеквенирование eDNA является полезной стратегией для оценки видового разнообразия Phytophthora в природных экосистемах.

Образец цитирования: Català S, Pérez-Sierra A, Abad-Campos P (2015) Использование пиросеквенирования родовых ампликонов для оценки видового разнообразия Phytophthora с использованием эДНК из почвы и воды в Северной Испании. ПЛОС ОДИН 10(3): е0119311. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119311

Академический редактор: Mark Gijzen, Министерство сельского хозяйства и продовольствия Канады, КАНАДА

Получено: 1 августа 2014 г . ; Принято: 12 января 2015 г.; Опубликовано: 16 марта 2015 г.

Авторское право: © 2015 Català et al.Эта статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Три прогона пиросеквенирования были объединены в один файл и депонированы в GenBank-SRA под регистрационным номером SRP027499. Консенсусные нуклеотидные последовательности каждой MOTU Phytophthora были депонированы в GenBank (инвентарный номерс AF132232 по AF132286).

Финансирование: Этот проект был поддержан Национальным институтом исследований и технологий аграрной и пищевой промышленности (EUPHRESCO-CEP: «Current and Emerging Phytophthoras: Research Supporting Assessment Risk and Management Risk»). Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

В последние годы рост мировой торговли растениями и перемещения людей повысили риск интродукции инвазивных растений и экзотических патогенов [1–3]. Биологические инвазии действуют глобально и считаются второй причиной утраты биоразнообразия после прямого изменения и разрушения среды обитания. В этом контексте вид Phytophthora имеет особое значение во всем мире, поскольку они являются основными патогенами в сельском хозяйстве, садоводстве и лесном хозяйстве, нанося значительный экономический и экологический ущерб.

Экологическая ДНК (эДНК) из таких образцов, как почва, вода, воздух или вечная мерзлота, представляет собой сложную смесь геномной ДНК из живых клеток и внеклеточной ДНК из естественной гибели клеток многих различных организмов [4]. В последние годы изучение эДНК в экологических исследованиях используется для характеристики микробных и грибных сообществ с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования (ВТС) [5–10] и для обнаружения чужеродных видов в почвенных образцах [11]. eDNA также успешно используется для обнаружения популяций с низкой плотностью в пресноводной среде [12], озерах [13], [14] и водоносных горизонтах [15].Большинство исследований были сосредоточены на обнаружении всех организмов, присутствующих в образцах окружающей среды, с использованием генов рДНК [16–19], но лишь немногие были нацелены только на один организм/род [20], [21].

Традиционно для обнаружения видов Phytophthora использовались различные методы, основанные на выделении на селективных средах или с использованием различных методов приманки. Однако эти методы требуют много времени и иногда дают ложноотрицательные результаты из-за малого количества доступного инокулята. Кроме того, идентификация на основе морфологических характеристик требует специальной таксономической экспертизы и значительных усилий. Напротив, для обнаружения Phytophthora spp. были разработаны и применены различные методы на молекулярной основе. в пробах окружающей среды. Эти методы позволяют быстро и точно обнаруживать и идентифицировать патогены даже при небольшом количестве инокулята, а также возможно количественное определение специфических патогенов Phytophthora с использованием ПЦР в реальном времени [22–25]. Для обнаружения 98 описанных и 15 неописанных видов Phytophthora был разработан мембранный олигонуклеотидный массив [26].Клонирование также применялось для оценки сообществ Phytophthora , присутствующих в пробах почвы и воды [27], но низкая производительность метода снижает вероятность обнаружения редких или вновь интродуцированных видов с низким уровнем инокулята. Различные исследования применяли HTS для обнаружения вида Phytophthora в образцах почвы [10], [11], [28], [29], но на сегодняшний день не для воды.

Увеличение экономических и экологических потерь, вызванных инвазивными видами Phytophthora в природных экосистемах, оправдывает внедрение эффективных и быстрых методов их обнаружения и точной идентификации. В этом исследовании родоспецифичные праймеры были адаптированы для оценки видового разнообразия Phytophthora в природных экосистемах с использованием высокопроизводительного пиросеквенирования ампликонов кДНК из почвы и водной среды на основе полиморфной и широко распространенной мишени для штрих-кодирования Internal Transcribed Spacer 1 (ITS1). и подтверждены контрольной реакцией с ДНК чистых культур. Целью данного исследования было применение HTS для изучения присутствия Phytophthora в различных растительных сообществах в естественных лесах, на плантациях и в водной среде на севере Испании.

Материалы и методы

Образцы культур

Чистые культуры Phytophthora gonapodyides (PS-1512), P . таксон PgChlamydo (PS-1510), P . лакустрис (ПС-1513), Р . криптогея (PS-1584), P . цитрофтора (ПС-1544), Р . plurivora (PS-1514), P cambivora (PS-1556) и P . cinnamomi (PS-1520) были получены из коллекции культур грибов Instituto Agroforest Mediterráneo Политехнического университета Валенсии (Испания).Идентичность этих культур была предварительно определена путем секвенирования области ITS.

Зоны отбора проб и проб окружающей среды

Были изучены две географические области. Вильянуа (Центральные Пиренеи, Арагон, Испания), который был выбран в качестве леса из чистой европейской пихты ( Abies alba ) (42°04′13″ с.ш., 0°03′13″ з.д.) и леса Ирати (42°56′). -43°00′ с.ш., 1°10′-0°58′ в.д.), расположенный на севере Испании (Западные Пиренеи, Наварра, Испания). Основным типом растительности леса Ирати являются либо местные буковые насаждения ( Fagus sylvatica ), либо смешанные леса из бука и пихты европейской ( Abies alba ), хотя можно найти недавние посадки кипариса Лоусона ( Chamaecyparis lawsoniana ). или пихта Дугласа ( Pseudotsuga menziesii ) в некоторых районах.

Администрация лесного хозяйства Наварры предоставила специальное разрешение на отбор проб на охраняемой территории леса Ирати. Для отбора проб в Вильянуа не требовалось специального разрешения. В этом исследовании не участвовали исчезающие или охраняемые виды.

Образцы почвы

В Вильянуа в июне 2012 г. было отобрано шесть почв из-под пихты европейской (AS). В лесу Ирати образцы почвы были отобраны в октябре 2012 г. в 24 различных местах, выбранных в соответствии с их основным растительным сообществом.Количество проб каждого типа растительности было пропорционально их площади в лесу: десять проб были отобраны из буковых насаждений (F), шесть из пихты Дугласа (PS), пять из пихты европейской (AB) и три из кипариса Лоусона ( Ч). Каждая проба состояла из проб почвы из шести разных точек, выбранных случайным образом и смешанных друг с другом (примерно 3 кг почвы/образец). Пробы собирали вокруг деревьев на расстоянии 1 м от основного ствола путем выкапывания на глубину около 30 см.

Пробы воды

Всего было проанализировано 15 проб воды, две пробы воды из Вильянуа (R1) и 13 проб воды из рек и ручьев в лесу Ирати (R2) в течение октября 2012 года. Пробы были взяты после нескольких дней дождя. Пробы воды (10 л) отбирали из рек и ручьев с использованием пластиковых контейнеров. Вода была отфильтрована in situ с использованием чистого ранцевого опрыскивателя для перекачивания воды, оснащенного полипропиленовым фильтродержателем Swinnex диаметром 47 мм (Millipore Corp. Bedford, MA, USA) с автоклавируемым фильтром с размером пор 5 мкм (ацетат целлюлозы). и смесь нитрата целлюлозы) (SMWP04700, Millipore, Ирландия). Первоначально собранная вода фильтровалась в распылитель через сетку с размером пор 100 мкм для удаления любого мусора.Затем воду откачивали с использованием трех фильтров на 10 л воды. Каждый фильтр осторожно удаляли стерилизованным пинцетом и разрезали пополам дезинфицированными ножницами. Фильтр хранили в стерилизованной полипропиленовой пробирке объемом 15 мл (Deltalab S.A., Барселона, Испания). Пробирки хранились в холодильнике во время полевого отбора проб и в морозильной камере (-20°C) один раз в лаборатории. Распылитель промывали 70% этанолом и тщательно промывали водой перед отбором проб в каждом месте.

Экстракция ДНК

Каждый образец почвы (до 3 кг) хорошо перемешивали и гомогенизировали путем просеивания (размер ячеек 2 мм), 50–80 г лиофилизировали в течение ночи, а затем измельчали ​​с помощью роторной мельницы с регулируемой скоростью FRITSCH-PULVERISETTE 14 (ROSH, Оберштайн, Германия). ).Образцы выдерживали при 5°C до выделения ДНК.

Из каждого образца почвы было взято до трех подпроб, и общая геномная ДНК была извлечена из 300 мг каждой подвыборки с использованием ZR Soil Microbe DNA MiniPrep (Zymo Research, Ирвин, США) в соответствии с инструкциями производителя, но с окончательными элюциями через 50 мкл буфера для элюции вместо 100 мкл буфера для элюции.

Фильтры из образцов воды (3 фильтра на образец) сначала замораживали при температуре -80°C, а затем разрушали с помощью компактной бисерной мельницы TissueLyser LT (Qiagen, Великобритания). ДНК экстрагировали из каждого из разрушенных фильтров с помощью E.Z.N.A. Plant Kit (Omega Bio-tek, Doraville, США) в соответствии с рекомендациями производителя, но с конечными элюциями в 50 мкл буфера для элюции вместо 100 мкл буфера для элюции.

ДНК экстрагировали из чистых культур с помощью E.Z.N.A. Plant Kit (Omega Bio-tek, Доравилль, США) согласно рекомендациям производителя.

Контрольная реакция

Каждую геномную ДНК из культур разбавляли в 10, 100 и 1000 раз и амплифицировали отдельно с использованием ПЦР в реальном времени SYBR green со специфическими праймерами Phytophthora 18Ph3F и 5.8С-1Р [27]. ДНК, имеющие сходные значения порога цикла, смешивали вместе, чтобы учесть различия в количестве копий ITS.

Генерация библиотеки Amplicon и пиросеквенирование 454

библиотеки ампликонов были созданы с использованием метода вложенной ПЦР с использованием полимеразы Hot Start (Dominion MBL, Кордова, Испания). В первом раунде ПЦР использовали Phytophthora -специфичные праймеры 18Ph3F и 5. 8S-1R [27]. Для второго раунда ПЦР праймеры для слияния были разработаны в соответствии с Руководством GS Junior System по экспериментальному дизайну ампликона [30], выбрав протокол однонаправленного секвенирования для создания библиотеки (химия Lib-L для эмульсионной ПЦР, эмПЦР, «одностороннее считывание»). .Матричная последовательность прямого праймера слияния представляла собой универсальный праймер ITS6 [31] (5′-A-KEY-MID-ITS6–3′), в то время как последовательность обратного праймера слияния представляла собой тот же самый обратный праймер, который использовался в первом Раунд ПЦР (5′-B-KEY-5.8S-1R-3′), где A и B представляют собой адаптеры для пиросеквенирования, а мультиплексный идентификатор (MID) был добавлен для идентификации образца после секвенирования. В случае образцов почвы в первом раунде ПЦР использовали 1 мкл геномной ДНК, а в случае образцов воды геномную ДНК разбавляли в десять раз (приблизительно 0.2–2 нг использовали в качестве матрицы в обоих источниках ДНК). Продукты ПЦР первого раунда разбавляли в 10 раз (пробы почвы) или в 100 раз (пробы воды) для второго раунда ПЦР, и в этом случае в качестве матрицы использовали 1 мкл. Условия ПЦР: 1 цикл при 95°С в течение 2 мин, 30 циклов (1-й цикл) или 25 циклов (2-й цикл) при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с и окончательное удлинение 72°С в течение 7 мин. Для контрольной реакции в первом раунде ПЦР (30 циклов) использовали 1 мкл геномной ДНК, во втором раунде (25 циклов) в качестве матрицы использовали 1 мкл продукта ПЦР.

Продукты ПЦР визуализировали на биоанализаторе 2100 (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния, США). Ампликоны из образцов почвы и чистой культуры подвергали двойной очистке с использованием протокола очистки Agencourt AMPure XP Bead PCR Purification (Beckman Coulter Genomics, Массачусетс, США). Однако в случае проб воды был использован другой метод с целью избежать неспецифических продуктов, соответствующих другим организмам с более длинными фрагментами ITS1, чем Phytophthora , а также химер, которые могли снизить качество секвенирования.Каждый продукт ПЦР из проб воды очищали с помощью E-Gel SizeSelect (Invitrogen, Burlington, ON, Канада) и извлекали полосы между 290 и 450 п. н. для секвенирования.

После очистки ампликоны визуализировали в Bioanalyzer 2100 и количественно определяли флуориметрически с использованием набора Quant-iT PicoGreen (Invitrogen Molecular Probes, Юджин, Орегон, США). Три продукта ПЦР из каждого образца почвы и воды смешивали вместе в зависимости от их концентрации для получения одного продукта.45 полученных ампликонов из семи областей (каждая область идентифицируется с индивидуальным MID) объединяли в равных концентрациях для секвенирования.

библиотеки ампликонов были секвенированы в системе GS Junior 454 (Roche 454 Life Sciences, Бранфорд, Коннектикут, США) Службой секвенирования и генотипирования Университета Валенсии (Буржассот, Испания). Три разных условия эмПЦР были протестированы в трех разных циклах секвенирования. Первый запуск проводился в соответствии со стандартным протоколом эмПЦР-амплификации компании «Рош» для экспериментального дизайна «Одностороннее считывание», второй запуск проводился с использованием того же протокола, но с удалением более крупных ампликонов с помощью E-Gel SizeSelect, а в третьем — эмульсия выполняли в соответствии с протоколом библиотеки ампликонов короткой длины. Библиотеку из чистых культур секвенировали в четвертом цикле секвенирования в соответствии с протоколом короткой длины.

Обрезка и молекулярная операционная таксономическая единица (MOTU), кластеризация

Сначала последовательности были отсортированы в отдельные файлы в соответствии с их мультиплексным идентификатором (MID) с использованием сценария sfffile, включенного в пакет Roche Newbler (http://www.454.com/products/analysis-software/). Последовательности из каждого файла SFF были извлечены с помощью сценария sff_extract (http://bioinf.comav.upv.es/sff_extract/index.html) для создания отдельных файлов FASTA, XML и качества. Файлы FASTA и качества были объединены в один файл FASTQ с использованием скрипта Python (Python версии 2.7, Python Software Fdn), а затем открыты в программе FastQC [32] для проверки длины и качества считываний.

чтения были обрезаны на основе показателей качества с использованием программного обеспечения Lucy [33]. Длина последовательности менее 100 п. н. и низкое качество чтения (среднее качество чтения ниже 20) не учитывались для анализа.Последовательности из трех запусков секвенирования были объединены в один файл FASTA после обрезки по качеству. Был создан новый скрипт Python для обрезки 3’-конца (адаптер B, ключ и обратный праймер) и 5’-конца (ключ, MID и прямой праймер). Этот сценарий включал новый шаг для удаления последовательностей короче 100 п.н. после второй обрезки.

Различные пороговые значения охвата баллов были протестированы для кластеризации MOTU с помощью специально подобранной базы данных, включающей 146 последовательностей ITS1 описанных и новых таксонов Phytophthora , а также последовательности видов, использованных в контрольной реакции.Результирующий файл FASTA из каждой библиотеки был кластеризован с порогом охвата длины 90% и порогом охвата оценки 99% (-L 0,9 -S 99) с использованием программного обеспечения blastclust [34]. После кластеризации для преобразования каждого MOTU из выходного файла списка кластеризации в отдельный файл FASTA использовался специальный скрипт Python, сортировка MOTU в порядке убывания распространенности с удалением уникальных последовательностей (синглетонов), а затем их выравнивание с помощью MUSCLE. [35]. Каждое выравнивание проверялось вручную в программном обеспечении Seaview [36], и, наконец, из каждой MOTU была сгенерирована согласованная последовательность с целью уменьшения ошибок гомополимера и секвенирования.

Консенсусные последовательности MOTU были идентифицированы с помощью инструмента BLAST в базе данных GenBank [34], базе данных Phytophthora [37] и специально подобранной базе данных, содержащей последовательности Сэнгера, показывающие несмешанную хоматограмму, полученную из образцов окружающей среды и культуры. коллекции, хранящиеся в Instituto Agroforest Mediterráneo Политехнического университета Валенсии (Испания). Одна последовательность была выбрана случайным образом в тех MOTU, которые имели два чтения. Консенсусные последовательности подвергали филогенетическому анализу для подтверждения результатов, полученных в результате поиска BLAST.

Результаты

Производительность секвенирования и контроль качества

Три различных протестированных режима эмПЦР дали 1142 считывания хорошего качества в первом цикле, 14 289 (10 233 использовано в настоящем исследовании) во втором и 140 767 считываний в третьем цикле.

Общий набор данных из трех запусков секвенирования включал 152 142 последовательности хорошего качества. Результаты, полученные для каждой библиотеки: 7 206 последовательностей для библиотеки 1 (R1), 47 419 для библиотеки 2 (R2), 13 543 для библиотеки 3 (CH), 19 796 для библиотеки 4 (PS), 21 982 для библиотеки 5 (AB), 26 527 последовательностей. для библиотеки 6 (F) и 15 669 для библиотеки 7 (AS).После обрезки 151 311 последовательностей были рассмотрены для анализа. Среднее качество отфильтрованных последовательностей составило 36, а средняя длина прочтения — 306 п.н.

Анализ порогового значения покрытия

Для проверки оптимального порогового значения использовалась эталонная база данных, содержащая 146 последовательностей ITS1 описанных и новых таксонов Phytophthora . Файл FASTA, содержащий последовательности ITS1, был создан и сгруппирован по разным пороговым значениям. Кластеризация на 100% или на 99.5%, выделено большее количество видов Phytophthora из и (рис. S1). Кроме того, на основе последовательностей ITS1 было невозможно разделить 10% видов с использованием 100% порога охвата баллов.

Использование порога охвата 99% позволило разделить наибольшее количество видов Phytophthora в контрольной реакции, как показано на рис. S2. Кластеризация при 99,5 или 100% также разделила восемь видов Phytophthora . Однако количество синглетонов увеличивалось экспоненциально из-за наличия ошибок секвенирования и гомополимеров, что приводило к большим потерям данных.Поэтому для всего анализа для кластеризации MOTU использовалось пороговое значение охвата 99% баллов.

Контрольная реакция

Всего было создано 6698 последовательностей из контрольной реакции, включающей восемь видов Phytophthora . После контроля качества для анализа были рассмотрены 6683 последовательности. Применяя рассчитанный ранее порог охвата 99% баллов, всего было получено 555 MOTU, включая 529 одноэлементных. MOTU с наибольшим количеством последовательностей соответствовали восьми видам Phytophthora . Идентичность консенсусных последовательностей с чтениями Сэнгера во всех случаях составляла 100% или 99,5%. Несовпадения во всех случаях были основаны на гомополимерных участках. Распределение прочтений для каждого вида показано в таблице 1.

Анализ MOTU из образцов эДНК почвы

Всего для анализа было рассмотрено 96 895 прочтений, прошедших контроль качества из образцов почвы (зоны отбора проб CH, PS, AB, F и AS). Кластеризация 96 895 прочтений привела к 8 151 MOTU, включая 8 114 синглетонов, которые были отброшены для анализа.37 неодиночных MOTU соответствовали 13 90 581 виду Phytophthora 90 582, включенным в клады 1, 4, 6, 7 и 8 (рис. 1) из четырех растительных сообществ: 90 581 A 90 582 . белый , C . Lawsoniana , P . мензиесии и F . лесной .

Рис. 1. Филограмма без корней, основанная на анализе последовательности ядерной рДНК ITS1, построенная с использованием подхода максимального правдоподобия.

Каждая из MOTU включает приоритет библиотеки (R1, R2, CH, AB, F, PS или AS), количество MOTU, в результате которого была кластеризована 99% каждой библиотеки, количество чтений и источник (W, вода; S , почва).Вертикальные полосы указывают на вид Phytophthora . MOTU, соответствующие неописанным видам, обозначены как «sp» (от sp1-sp12).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0119311.g001

Специфичность методики обнаружения Phytophthora в почвах составила 98,46%. Не- Phytophthora MOTU (1,54% неодиночных кластеризованных прочтений) соответствовали другим родам патогенов растений, таким как Pythium и Hyaloperonospora (таблица 2).

Таблица 2. Чтение распределения видов, отличных от Phytophthora , на основе ITS1 после BLASTn консенсусных последовательностей, выполненных против GenBank.

Чтения из MOTU с сходством более 99% выделены жирным шрифтом.

https://doi. org/10.1371/journal.pone.0119311.t002

Анализ MOTU из образцов водной эДНК

Всего для анализа было рассмотрено 54 416 прочтений эДНК воды из участков отбора проб R1 и R2, прошедших контроль качества.Кластеризация 54 416 прочтений привела к 3 646 MOTU, включая 3 548 синглетонов, которые были отброшены для анализа. 98 неодиночных MOTU соответствовали 35 90 581 виду Phytophthora 90 582 (рис. 1) из клад 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 и 10 (рис. 1). В ветвях 5 и 9 не обнаружено видов Phytophthora. вида. Наибольшее количество видов приходится на клады 6 и 8, по девять видов в каждой. Был обнаружен только один вид из клады 2, соответствующий видам комплекса Phytophthora citricola .Тремя наиболее распространенными MOTU в пробах воды были P . gonapodyides (29 432 чтения), за которым следует P . lacustris (6341 чтение) и P . syringae (5528 прочтений). Было получено пятнадцать последовательностей вида Phytophthora (названного Phytophthora sp. 13), последовательности которых не совпадали ни с одной последовательностью в общедоступных базах данных и не кластеризовались ни в одной из описанных ветвей ITS. Наиболее близким совпадением в GenBank было Phytophthora sp.REB326-69 (номер доступа JX122744) с гомологией последовательностей 89%. Этот MOTU не был включен на рис. 1, так как он был слишком расходящимся.

Специфичность анализа пиросеквенирования эДНК в воде для обнаружения Phytophthora составила 96,92%. NON- Phytophthora Motus (3,08% счастки Nonsingleton Clustered Reads) сопоставляется с другими генерами патогена растений, таких как Hyaloperonospora , Bremia , Peronospora , Pythium или члены неопределенного рода Oomcete, не представленные в Генбанке ( Таблица 2).

Обсуждение

Обнаружение Phytophthora в образцах окружающей среды с помощью высокопроизводительного ампликона пиросеквенирования кДНК показало высокую специфичность и может быть использовано в дальнейшем для оценки разнообразия Phytophthora в природных экосистемах.

100%-ная кластеризация была лучшим критерием для разделения большинства видов в справочной базе данных. В других исследованиях [38] был принят порог штрих-кодирования 98% для определения большинства прочтений. Однако в текущем исследовании мы включили смесь контрольных видов, и для различения близкородственных видов требовался порог 99%, что привело к разделению на 20% больше видов.

Для данных контрольной реакции кластеризация при сходстве 99% была минимальным значением, позволяющим разделить все виды с минимальным количеством потерянных прочтений. Кластеризация на 99,5% или 100% приводила к потере прочтений из-за присутствия гомополимера и ошибок секвенирования, которые отбрасывались как одиночные. Значений ниже 99% было недостаточно для разделения P . gonapodyides и P . таксон PgChlamydo в отдельных MOTU. В этом исследовании кластеризация при сходстве 99% позволила отделить большинство видов из клады 6, обнаруженных в пробах воды из окружающей среды, и снизила риск ложных MOTU, полученных из-за ошибок секвенирования. Хотя объединение для контрольной реакции было сделано путем смешивания ДНК на основании сходных значений CT, число полученных последовательностей составило P . plurivora оказался ниже, чем ожидалось, и это может быть потенциальной проблемой, которую следует учитывать при интерпретации результатов.

Ограничения области ITS1 для таксономической идентификации Phytophthora особенно очевидны в ветвях 1 и ветвях 2 с P . citricola [39] и в ветвь 6, которая включает множество водных видов, где многие виды идентичны или отличаются на 1 п.н. в ITS1.Применяя сходство 100% между последовательностями, все еще невозможно разделить 10% видов в справочной базе данных, включая виды из клады 1 ( P . infestans , P . ipomoeae , P . Mirabilis , P , P . P . Andina ), от Clade 2 ( P . Capensis , P , P . Taxon Emanzi) или Clade 6 ( P . Gibbosa , P . грегата ).Несмотря на эти ограничения, он остается мощным инструментом для различения большинства известных видов, а также для выявления новых.

Условия эмПЦР-амплификации (2,2 млн копий матрицы и 80 мкл Amp Primer A), использованные в первом и втором циклах секвенирования, приводили к рассеянию света в близлежащие лунки и вызывали их устранение из-за фильтрации обработки сигнала. Третий запуск секвенирования был выполнен в соответствии с рекомендациями для библиотек короткой длины, которые уменьшили количество Amp Primer A в Live Amp Mix с 80 до 20 мкл.Хотя длина ампликонов ITS1 в окружающей среде не соответствовала определению библиотек короткой длины (ампликоны размером 340 п.н. вместо ампликонов <250 п.н.), использование этого протокола увеличило пропускную способность в 100 раз по сравнению с первым циклом пиросеквенирования.

Аналогичные исследования, основанные на пиросеквенировании образцов почвы из буковых лесов во Франции, выявили присутствие только четырех видов Pythiaceae (что соответствует 0,8% последовательностей из набора данных), представленных двумя видами Phytophthora : P . plurivora и неидентифицированный вид Phytophthora из клады 7а [10]. Их методология создания библиотеки была основана на методе вложенной ПЦР, где первая ПЦР была основана на амплификации всей области ITS с парой праймеров ITS6/ITS4 [31], [40], а пиросеквенирование было основано на праймерах ITS6/ITS7. [31]. Эта стратегия пиросеквенирования показала более низкую эффективность и специфичность для обнаружения Phytophthora по сравнению с методологией, реализованной в этом исследовании.Пропускная способность амплификации крупных мишеней, таких как вся область ITS в роде Phytophthora (до 840 п.н.), обычно является проблемой в образцах окружающей среды, особенно в почвах с обилием ингибиторов гуминовых кислот и высокой деградацией ДНК. Важность длины целевого участка заключается в том, что короткие фрагменты ДНК (менее 300–400 п.н.) обычно очень медленно деградируют, что позволяет обнаруживать их в пробах окружающей среды [41]. Реализация крупномасштабных экологических исследований на основе эДНК сильно зависит от наличия подходящих коротких меташтрих-кодов [4]. Следовательно, использование в первой ПЦР праймеров, специфичных для Phytophthora , которые включают ITS1 и небольшую часть 18S (длина ампликона от 419 до 484 п.н.), а не всей области ITS, обеспечивает лучшие результаты амплификации для метагеномики. исследования.

Напротив, другие исследователи [11] применили те же праймеры ITS6/ITS7 для пиросеквенирования без использования вложенного подхода, выявив присутствие 15 видов Phytophthora в почвах каштановых лесов в Италии.Их анализ был очень специфичным для обнаружения видов Phytophthora , где 78,8% последовательностей (9167 из 11637 прочтений) соответствовали Phytophthora .

В этом исследовании для получения подходящих продуктов ПЦР использовался вложенный подход, поскольку при одном раунде ПЦР не было получено амплификации [27]. Гнездовая ПЦР повышает чувствительность и специфичность по сравнению с методами негнездовой ПЦР, но также увеличивает риск перекрестного загрязнения. Чтобы еще больше снизить количество ложноположительных результатов, основанных на перекрестном загрязнении, необходимо соблюдать крайнюю осторожность во время выделения ДНК, подготовки реакций ПЦР и этапов после ПЦР.

С методологической точки зрения процедуры предварительной обработки почвы (сушка, просеивание, лиофилизация, измельчение и взвешивание) являются трудоемкими по сравнению с фильтрационной обработкой воды. Работа с пробами воды позволяет провести обработку и формирование библиотеки ампликонов за один день. Пиросеквенирование образцов почвы выявило более низкое разнообразие Phytophthora , чем в образцах воды, где было обнаружено только тринадцать видов в пяти различных экосистемах, включающих 30 участков отбора проб.Наибольшее количество видов было обнаружено на трех участках отбора проб из 90 581 плантаций Chamaecyparis 90 582, где было обнаружено 10 из 13 90 581 видов Phytophthora 90 582. Особенно удивительно, что так мало видов было обнаружено в образцах почвы Abies alba из леса Ирати, где только два вида, P . лакустрис и P . Обнаружено шприцев . Точно так же в пределах Pseudotsuga menziesii ассоциированных образца почвы, где были обнаружены только три вида. Пиросеквенирование эДНК воды из рек и ручьев выявило скрытое и неожиданно высокое разнообразие видов Phytophthora . Всего было обнаружено 35 видов Phytophthora , 13 из которых могут представлять собой потенциально новые виды. Разнообразие видов Phytophthora из проб воды в лесу Ирати включало все виды, обнаруженные в пробах почвы из той же области отбора проб. Однако виды, обнаруженные в пробах воды и почвы в Вильянуа, были другими. Это может быть связано с тем, что в этом лесу было взято небольшое количество проб, а также с разным временем отбора проб.

ДНК, извлеченная из фильтров, вероятно, состоит из ДНК живых клеток (в основном зооспор) и внеклеточной ДНК, полученной в результате естественной гибели клеток в воде. Они могут присутствовать в самой воде или образоваться в результате смывания почвы после дождей. Другие исследования [42] показали, что фрагменты ДНК в пресноводных экосистемах сохраняются менее одного месяца. Это указывает на то, что путем отбора проб сразу после дождя можно восстановить максимальное количество ДНК, содержащей потенциальное сообщество Phytophthora , из лесной и водной среды. Эта гипотеза согласуется с присутствием нескольких видов Phytophthora из большинства ветвей в водной эДНК, включая многие патогенные виды растений, обычно выделяемые из корней, такие как P . камбивора , P . niederhauserii , P . многоцветный , P . pseudosyringae или P . шприц .

Большинство из видов Phytophthora , выделенных из ирригационных водоемов и естественных водотоков, относятся к кладе 6.Эти виды, обычно называемые водяной плесенью, тесно связаны как с лесными, так и с прибрежными экосистемами [43–46], и хотя некоторые из них могут быть агрессивными древесными патогенами, такими как P . inundata в Испании [47], предполагается, что они ведут преимущественно водный и сапрофитный образ жизни [48]. В этом исследовании 73,6% прочтений принадлежали кладе 6, которая может представлять резидентное сообщество рек и ручьев. Наиболее распространенными обнаруженными видами были Phytophthora gonapodyides , P . мегасперма , P . таксон PgChlamydo, P . в ундата и P . lacustris , которые обычно выделяют приманкой из ручьев по всему миру [45], [49–53].

Phytophtora -специфичные праймеры [27], использованные в настоящем исследовании, показали высокую специфичность. В первоначальном исследовании ампликоны были клонированы, и всего было получено 260 ампликонов с полным отсутствием Pythium s . до видов.Обнаружена лишь незначительная перекрестная реакция с двумя филотипами ложной мучнистой росы. Однако в этом исследовании с использованием тех же праймеров с подходом HTS было получено 152 142 прочтения со специфичностью 97,9% к Phytophthora . Был получен лишь небольшой процент (2,1%) амплификации не- Phytophthora , включая род Hyaloperonospora , Bremia , Peronospora и Pythium .

Предыдущие методы (приманка образцов из окружающей среды и клонирование) требуют много времени и средств и часто могут давать ложноотрицательные результаты из-за низкой распространенности некоторых видов Phytophthora и неспособности неизвестных видов Phytophthora расти на некоторых искусственных средах. Применяемый здесь метод преодолевает эти проблемы и может дать результаты менее чем за одну неделю по сравнению с несколькими неделями или месяцами при использовании обычных методов, которые позволили бы заблаговременно реагировать на угрозы, исходящие от этих патогенов. Хотя аналогичные методы использовались в предыдущих исследованиях, пиросеквенирование родового ампликона впервые было использовано для нацеливания только на Phytophthora в образцах почвы и воды, открывая ранее скрытые сообщества Phytophthora .

Регистрационные номера

Три цикла пиросеквенирования были объединены в один файл и депонированы в GenBank-SRA под регистрационным номером SRP027499. Консенсусные нуклеотидные последовательности каждой Phytophthora MOTU были депонированы в GenBank (номер доступа от AF132232 до AF132286).

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Departamento de Desarrollo Rural, Industria, Empleo y Medio Ambiente из Наварры за их поддержку во время исследования; Fernando Martínez-Alberola (Университет Валенсии) за помощь в процедурах биоинформатики; Службе секвенирования Университета Валенсии за их интенсивную работу.

Вклад авторов

Идея и дизайн экспериментов: НЦ ПКК АПС. Выполняли эксперименты: КА АПС. Проанализированы данные: SC. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: SC PAC APS. Написал статью: СК АПС.

Каталожные номера

1. 1. Рейхард С.Х., Уайт П. Садоводство как путь интродукции инвазивных растений в Соединенных Штатах. Биология. 2001 г.; 51: 103–113.
2. 2. Джонс Д.Р., Бейкер RHA. Интродукция неместных патогенов растений в Великобританию, 1970–2004 гг.Завод Патол. 2007; 56: 891–910.
3. 3. Бразьер СМ. Угроза биобезопасности для Великобритании и глобальной окружающей среды от международной торговли растениями. Завод Патол. 2008 г.; 57: 792–806.
4. 4. Таберле П., Куасак Э., Хаджибабаи М., Ризеберг Л.Х. Экологическая ДНК. Мол Экол. 2012; 21: 1789–1793. пмид:22486819
5. 5. Согин М.Л., Моррисон Х.Г., Хубер Дж.А., Уэлч Д.М., Хаус С.М., Нил П.Р. и соавт. Микробное разнообразие морских глубин и малоизученная «редкая биосфера».Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(32): 12115–12120. пмид:16880384
6. 6. Реш Л.Ф., Фулторп Р.Р., Рива А., Казелла Г., Хадвин А., Кент А.Д. и др. Пиросеквенирование перечисляет и сопоставляет микробное разнообразие почвы. Журнал ИСМЕ. 2007; 1: 283–290. пмид:18043639
7. 7. Акоста-Мартинес В., Дауд С., Сан Ю., Аллен В. Анализ пиросеквенирования с кодированием тегов бактериального разнообразия в одном типе почвы в зависимости от управления и землепользования. Почва Биол Биохим. 2008; 40: 2762–2770.
8. 8. Джамппонен А., Джонс К.Л. Массивно параллельное секвенирование 454 указывает на гиперразнообразие грибковых сообществ в умеренной филлосфере Quercus macrocarpa . Новый Фитол. 2009; 184: 438–448. пмид:19674337
9. 9. Нильссон Р. Х., Риберг М., Абаренков К., Шёквист Э., Кристианссон Э. Область ITS как цель для характеристики грибковых сообществ с использованием новых технологий секвенирования. FEMS Microbiol Lett. 2009; 296(1): 97–101. пмид:19459974
10. 10.Coince A, Caël O, Bach C, Lengell J, Cruaud C, Gavory F, et al. Подземное мелкомасштабное распределение и обнаружение почвенных и мелких корней сообществ грибов и почвенных оомицетов во французском буковом лесу. Грибковая экол. 2013;6(3): 223–235.
11. 11. Ваннини А., Бруни Н., Томассини А., Франческини С., Веттраино А.М. Пиросеквенирование образцов почвы окружающей среды выявило биоразнообразие резидентного сообщества Phytophthora в каштановых лесах. FEMS Microbiol Ecol.2013;85(3): 433–442. пмид:23560715
12. 12. Джерде К.Л., Махон А.Р., Чаддертон В.Л., Лодж Д.М. «Невидимое» обнаружение редких водных видов с использованием ДНК окружающей среды. Сохрани латынь. 2011;4(2): 150–157.
13. 13. Monchy S, Sanciu G, Jobard M, Rasconi S, Gerphagnon M, Chabé M, et al. Изучение и количественная оценка разнообразия грибов в экосистемах пресноводных озер с использованием клонирования / секвенирования рДНК и пиросеквенирования тегов SSU. Окружающая среда микробиол. 2011;13(6): 1433–1453. пмид:21635672
14. 14.Джобард М., Раскони С., Солинхак Л., Коши Х.М., Симе-Нгандо Т. Молекулярное и морфологическое разнообразие грибов и связанные с ними функции в трех близлежащих озерах Европы. Окружающая среда микробиол. 2012;14(9): 2480–2494. пмид:22568577
15. 15. Ливермор Дж.А., Маттес Т.Е. Филогенетическое обнаружение новых Cryptomycota в водоносном горизонте Айовы (США) и в ранее собранных морских и пресноводных целевых наборах высокопроизводительного секвенирования. Окружающая среда микробиол. 2013;15(8): 2333–2341.пмид:23461624
16. 16. Накаяма Дж., Цзян Дж., Ватанабэ К., Чен К., Нинсин Х., Мацуда К. и др. Вплоть до анализа микробиоты кишечника человека на уровне видов с помощью пиросеквенирования ампликона 16S рРНК. Biosci Microbiota Food Health. 2013;32(2): 69–76. пмид:24936364
17. 17. Крир С., Синнигер Ф. Космополитизм микробных эукариот в глобальных морских глубинах. Мол Экол. 2012;21(5): 1033–1035. пмид:22360453
18. 18. Дэйви М.Л., Хигаард Э., Халворсен Р., Каусеруд Х., Олсон М.Обнаружение композиционных сдвигов в сообществах грибов, связанных с мохообразными, вдоль градиента высот на основе ампликон-пиросеквенирования. Мол Экол. 2013;22(2): 368–383. пмид:231
19. 19. Вебер К.Ф., Вилгалис Р., Куске К.Р. Изменения в составе грибкового сообщества в ответ на повышенное содержание CO ₂ в атмосфере и азотные удобрения различаются в зависимости от горизонта почвы. Фронт микробиол. 2013;4.
20. 20. Бергмарк Л., Поулсен П. Б., Аль-Суд В. А., Норман А., Хансен Л. Х., Соренсен С. Дж.Оценка специфичности количественной ПЦР Burkholderia и Pseudomonas для обнаружения этих родов в почве с использованием 454 пиросеквенирования. FEMS Microbiol Lett. 2012;333(1): 77–84. пмид:22639954
21. 21. Ли Л., Аль-Суд В.А., Бергмарк Л., Рибер Л., Хансен Л.Х., Магид Дж. и др. Изучение разнообразия Pseudomonas spp. в почве с использованием методов, зависящих от культуры, и независимых методов. Карр микробиол. 2013;67(4), 423–430. пмид:23677146
22. 22. Шена Л., Хьюз К.Дж., Кук Д.Э.Обнаружение и количественное определение Phytophthora ramorum , P . kernoviae , P . лимонная кислота и P . quercina в симптоматических листьях с помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени. Мол Плант Патол. 2006;7(5): 365–379. пмид:20507453
23. 23. Тули П.В., Мартин Ф.Н., Каррас М.М., Фредерик Р.Д. Флуоресцентная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени обнаруживает Phytophthora ramorum и Phytophthora pseudosyringae с использованием участков митохондриальных генов.Фитопатология.2006;96(4): 336–345. пмид:18943415
24. 24. Павон С.Ф., Бабадуст М., Ламберт К.Н. Количественное определение ооспор Phytophthora capsici в почве с помощью просеивания-центрифугирования и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Заводские дис. 2008; 92(1): 143–149.
25. 25. Чем DJ, Hughes KJD, Boonhan N, Tomlinson JA, Woodhall JW, Bellgard SE и др. ПЦР-анализ TaqMan в реальном времени для обнаружения Phytophthora «taxon Agathis» в почве, возбудителя Каури в Новой Зеландии.Лесной Патол. 2013;43(4): 324–330.
26. 26. Chen W, Djama ZR, Coffey MD, Martin FN, Bilodeau GJ, Radmer L, et al. Матрица олигонуклеотидов на основе мембран, разработанная из нескольких маркеров для обнаружения многих видов Phytophthora . Фитопатология. 2013;103(1): 43–54. пмид:23050746
27. 27. Шибетта С., Шена Л., Чименто А., Каччола С.О., Кук Д.Э.Л. Молекулярный метод оценки разнообразия Phytophthora в пробах окружающей среды. J Microbiol Meth.2012; 88: 356–368.
28. 28. Катала С., Перес-Сьерра А., Бербегал М., Абад-Кампос П. Первый подход к изучению разнообразия видов Phytophthora в лесах средиземноморского каменного дуба на основе 454 параллельных ампликонных пиросеквенирования образцов почвы. Phytophthora in Forest and Natural Ecosystems 6 ^th Международная рабочая группа IUFRO 7.02.09 Встреча, Кордова, Испания, стр. 34; 2012.
29. 29. Катала С., Перес-Сьерра А., Бельтран А., Абад-Кампос П.Секвенирование нового поколения показывает разнообразие видов Phytophthora и видов в образцах почвы макаронезийских лавровых лесов на Канарских островах. Phytophthora in Forest and Natural Ecosystems 6 ^th Международная рабочая группа IUFRO 7.02.09 Встреча, Кордова, Испания, стр. 86; 2012.
30. 30. Роше. Система GS Юниор; Руководство по экспериментальному дизайну ампликона. Брэнфорд: 454 Life Sciences Corp., 45 стр.; 2010.
31. 31. Кук Д.Э.Л., Дрент А., Дункан Дж.М., Вагельс Г., Бразиер К.М.Молекулярная филогения Phytophthora и родственных оомицетов. Генетика грибов Биол. 2000; 30:17–32. пмид:10955905
32. 32. Эндрюс С. FastQC: инструмент контроля качества для высокопроизводительных данных последовательностей. Доступно: http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc/. По состоянию на 3 февраля 2013 г.
33. 33. Чжоу Х.Х., Холмс М.Х. Качественная обрезка последовательности ДНК и удаление вектора. Биоинформатика. 2001;17(12): 1093–1104. пмид:11751217
34. 34. Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шеффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В. и др.Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска белковых баз данных. Нуклеиновые Кислоты Res. 1997;25(17): 3389–3402. пмид:9254694
35. 35. Эдгар РК. MUSCLE: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью. Нуклеиновые Кислоты Res. 2004; 32(5): 1792–1797. пмид:15034147
36. 36. Gouy M, Guindon S, Gascuel O. Seaview, версия 4: мультиплатформенный графический пользовательский интерфейс для выравнивания последовательностей и построения филогенетического дерева. Мол Биол Эвол. 2010;27(2): 221–224.пмид:19854763
37. 37. Пак Дж. , Пак Б., Вирарагхаван Н., Юнг К., Ли Ю.Х., Блэр Дж.Е. и др. База данных Phytophthora : криминалистическая база данных, поддерживающая идентификацию и мониторинг Phytophthora . Завод Дис. 2008; 92(6): 966–972.
38. 38. Веттраино А.М., Бонанц П., Томассини А., Бруни Н., Ваннини А. Пиросеквенирование как инструмент для обнаружения видов Phytophthora : частота ошибок и риск ложных молекулярных операционных таксономических единиц.Lett Appl Microbiol. 2012; 55: 390–396.
39. 39. Юнг Т., Берджесс Т.И. Повторная оценка изолятов Phytophthora citricola из нескольких древесных хозяев в Европе и Северной Америке выявила новый вид, Phytophthora plurivora sp. ноябрь Персония. 2009; 22: 95–110. пмид:20198142
40. 40. Уайт Т.Дж., Брунс Т.Д., Ли С.Б., Тейлор Дж.В. Амплификация и прямое секвенирование генов грибковых рибосомных РНК для филогенетики. В: Иннис М.А., Гельфанд Д.Х., Снинский Дж.Дж., Уайт Т. Дж., редакторы.Протоколы ПЦР. Сан-Диего: Academic Press, Inc., стр. 315–322; 1990.
41. 41. Дигл Б., Ивсон Дж. П., Джарман С. Количественная оценка повреждений ДНК, извлеченных из сильно разложившихся образцов — тематическое исследование ДНК в фекалиях. Фронт Зоол. 2006;3(1): 11.
42. 42. Дежан Т., Валентини А., Дюпарк А., Пелье-Кюит С., Помпанон Ф., Таберле П. и др. Стойкость ДНК окружающей среды в пресноводных экосистемах. ПЛОС ОДИН. 2011 г.; 6(8): e23398. пмид:21858099
43. 43. Гуха Рой С., Грюнвальд, штат Нью-Джерси.Погибель растений рода Phytophthora в 21 веке. В книге: Review of Plant Pathology, Edition: Volume 6, Publisher: Scientific Publishers (India), Jodhpur, Editors: BNChakraborty, BBLThakore, pp. В печати; 2014.
44. 44. Brasier CM, Cooke DEL, Duncan JM, Hansen EM. Множественные новые фенотипические таксоны из деревьев и прибрежных экосистем в Phytophthora gonapodyides – P . megasperma ITS Клада 6, которые, как правило, устойчивы к высоким температурам и либо инбридингу, либо стерильности.Микол рез. 2003; 107: 277–290. пмид:12825496
45. 45. Хюберли Д., Харди ГЕСЖ, Уайт Д., Уильямс Н., Берджесс Т.И. Промысел Phytophthora в водных путях Западной Австралии: исследование распространения и разнообразия. Австралийский завод Патол. 2013; 42: 251–260.
46. 46. Jung T, Stukely MJC, Hardy GSJ, White D, Paap T, Dunstan W, et al. Множественные новые виды Phytophthora из ITS Clade 6, связанные с природными экосистемами в Австралии: эволюционные и экологические последствия.Персония. 2011;26: 13–39:22025801
47. 47. Brasier CM, Санчес-Эрнандес Э., Кирк С.А. Phytophthora inundata sp. nov., часть гетероталличного патогена деревьев и кустарников во влажных или обводненных почвах. Микол рез. 2003; 107: 477–484. пмид:12825521
48. 48. Хансен Э.М., Ризер П.В., Саттон В. Phytophthora за пределами сельского хозяйства. Анну Рев Фитопат. 2012;50:359–378. пмид:22681450
49. 49. Ризер П.В., Саттон В., Хансен Э.М., Ремиги П., Адамс Г.К. Вид Phytophthora в лесных ручьях Орегона и Аляски. Микология. 2011;103(1): 22–35. пмид:20943547
50. 50. Ризер П., Саттон В., Хансен Э. Вид Phytophthora на деревьях таноака, кроне деревьев, почве и ручьях в районе эпидемии внезапной гибели дубов на юго-западе Орегона, США. Новое рвение J For Sci. 2011; 41: 65–73.
51. 51. Nechwatal J, Bakony J, Cacciola SO, Cooke DEL, Jung T, Nagy ZA, et al. Морфология, поведение и молекулярная филогения таксона Phytophthora Salixsoil и его переименование в Phytophthora lacustris sp.ноябрь Завод Патол. 2012.62(2): 355–369.
52. 52. Huai WX, Tian G, Hansen EM, Zhao WX, Goheen EM, Grünwald NJ и др. Идентификация вида Phytophthora , пойманных на приманку и выделенных из лесной почвы и ручьев в северо-западной провинции Юньнань, Китай. Лесной Патол. 2013;43(2): 87–103.
53. 53. О Э, Гризенхаут М., Вингфилд Б.Д., Вингфилд М.Дж., Берджесс Т.И. Исследования почвы и воды выявили золотую жилу разнообразия Phytophthora в природных экосистемах Южной Африки.ИМА Грибок. 2013;4(1): 123–131. пмид:23898418

Фитофтороз, поражающий декоративные растения | Bayer Environmental Science США

Phytophthora  заболевания, поражающие декоративные растения, и возможность лиственных вспышек являются результатом различных исследований болезней декоративных растений, проведенных за последнее десятилетие. Общение с диагностами, которые регулярно получают образцы болезней декоративных растений, указывает на то, что лиственные вспышки Phytophthora остаются постоянной проблемой, затрагивающей нашу отрасль.Похоже, что виды Phytophthora присутствуют во всех декоративных питомниках и могут вызывать серьезное заболевание, имеющее большое экономическое значение. Phytophthora  обычно заносится в теплицы и питомники через зараженные маточные растения, зараженные среды и загрязненную поливную воду. После внесения инокулят патогена может распространяться при разбрызгивании воды для орошения и в результате культурных мероприятий, таких как посадка в горшки, обрезка и перемещение растительного материала.

Открытие Phytophthora ramorum , вызывающего серьезное заболевание дуба и других пород деревьев в питомниках на западе США, подготовило почву для многочисленных исследований Phytophthora  . Обзор литературы о видах Phytophthora , связанных с декоративными растениями, показывает, что сообщается о многочисленных видах. С увеличением количества ученых, разрабатывающих более специфические и чувствительные методы обнаружения, мы, вероятно, увидим, что количество сообщений о видах Phytophthora , влияющих на производство декоративных растений, продолжает расти.В зависимости от типа сельскохозяйственных культур (например, тропическая листва, клумбовые растения, древесные декоративные растения) и географического положения присутствующие виды Phytophthora могут сильно различаться. Например, есть шесть видов Phytophthora , зарегистрированных на тропической листве, а P. nicotianae  являются одними из наиболее распространенных, вызывающих лиственные вспышки. Сообщалось о более чем дюжине видов Phytophthora , связанных с лиственными болезнями древесных декоративных растений, причем P. citricola  является одним из наиболее распространенных.

Крайне важно, чтобы производители понимали обнаружение Phytophthora  на своих растениях и среди них. Инокулят этого патогена, способного вызывать корневую гниль, а также заболевания листьев, увеличивается от низкого (даже настолько низкого, что его невозможно обнаружить) до высокого уровня в течение нескольких дней в зависимости от условий. Увеличение инокулята обусловлено быстрым образованием спорангиев и зооспор из инфицированных тканей растения при наличии свободной влаги. Phytophthora имеет короткое время генерации и высокую репродуктивную способность, что часто приводит к вспышкам болезни за короткий период времени. Иногда кажется, что болезнь может включиться буквально за одну ночь. Наличие свободной влаги и период увлажнения листьев являются наиболее важными факторами окружающей среды, связанными с лиственными вспышками Phytophthora . Влажность листьев — это наличие свободной воды на поверхности листа растения в результате дождевания, дождя, тумана или росы, которая может образовываться на любой поверхности растения, в основном на верхней и нижней сторонах листьев. Таким образом, методы орошения для сведения к минимуму влажности листьев и надлежащее расстояние между растениями, обеспечивающее движение воздуха через полог, являются важными стратегиями борьбы с болезнями для борьбы с лиственными вспышками  Phytophthora .

---

Тяжелая гниль листьев Pachira aquatica (денежное дерево), вызванная Phytophthora palmivora.

Листья Mandevilla с пятнами от коричневого до черного цвета и водянистыми краями, вызванными Phytophthora nicotianae.

Развитию болезни чаще всего способствует жаркая влажная погода, характерная для наших летних месяцев.Растения, которые поливают с помощью дождевания и содержат в условиях, когда листья не сохнут, наиболее подвержены лиственным вспышкам, вызванным Phytophthora . Было разработано несколько фунгицидов для использования на декоративных растениях, зараженных Phytophthora . К ним относятся этридиазол (FRAC 14), мефеноксам (FRAC 4), фенамидон (FRAC 11), пропамокарб (FRAC 28) и фосетилалюминий (FRAC 33). Более современные фунгициды включают циазофамид (FRAC 21), диметоморф и мандипропамид (FRAC 40), флуопиколид (FRAC 43) и оксатиапипропалин (FRAC U15).Каждое из этих соединений продемонстрировало превосходную активность в борьбе с Phytophthora в условиях декоративного производства. Когда дело доходит до эффективной борьбы с агрессивными патогенами, такими как Phytophthora , профилактическое применение фунгицидов является обязательным. При применении любого пестицида всегда обращайтесь к этикетке производителя за рекомендуемыми дозами и интервалами применения. Как лейбл — это закон. Статья первоначально была опубликована в GrowerTalks 30 июня 2017 г.

Ранние симптомы ожога листьев антуриума, вызванного Phytopthora nicotianae.

 

Продукция Bayer Ornamentals, помогающая бороться с фитофторозом, включает:

---

 

Болезнь Раморум (Phytophthora ramorum) — Лесные исследования

Присутствует в Великобритании

Подлежит уведомлению – см. «Сообщить о наблюдении» ниже

Научное название возбудителя – Phytophthora ramorum ( P.раморум )

Phytophthora ramorum — очень разрушительный водорослеподобный организм, называемый водяной плесенью. Он наносит значительный ущерб и гибель более чем 150 видам растений, в том числе некоторым лесным видам. Общее название болезней, которые он вызывает, — болезнь Раморума.

Восприимчивые виды

Среди лесных растений лиственницы (деревья из рода Larix ), которые широко выращиваются в Соединенном Королевстве (Великобритания) для рынка древесины, особенно восприимчивы, и большое их количество было поражено.На картинке выше деревья с коричневой, серой и рыжей листвой — это лиственницы с болезнью раморум.

Болезнь Ramorum на лиственницах иногда также упоминается в Великобритании как «болезнь лиственницы», «болезнь лиственницы японской» (хотя европейская и гибридная лиственницы также являются хозяевами) и «внезапная гибель лиственницы».

Он также был обнаружен на европейских сладких каштанах ( Castanea sativa ) в ряде мест в южной и центральной Англии. См. «Болезнь Раморума на каштане сладком» ниже.

Болезнь Ramorum на дубах известна как «внезапная смерть дуба», особенно в США. Там генетические формы организма P. ramorum , отличные от присутствующих в Великобритании, нанесли значительный ущерб местным видам североамериканского дуба ( Quercus ) и таноака ( Notholithocarpus ). Однако генетические формы организма, обнаруженные в Великобритании, мало повлияли на два наших местных вида дуба, а именно дуб черешчатый или дуб черешчатый ( Quercus robur ) и дуб скальный ( Q.петреа ).

Бук ( Fagus sylvatica ), бук южный ( виды Nothofagus ) и некоторые неместные виды дуба, включая дуб красный ( Quercus rubra ), дуб индейки ( Q. cerris ) и дуб каменный ( Q , ilex ), также являются случайными хостами.

Европейский сладкий каштан ( Castanea sativa ) также является хозяином, и с 2015 г. на юге Англии было обнаружено все большее число пораженных (см. Следующий раздел). Конский каштан ( Aesculus hippocastanum ) также может быть инфицирован.

Другие виды хвойных, такие как пихта Дугласа ( Pseudotsuga menziesii ), пихта великая ( Abies grandis), пихта благородная ( A. procera) и тсуга западная ( Tsuga heterophylla ), могут быть инфицированы при выращивании рядом с инфицированными лиственница.

Это также было подтверждено на небольшом количестве ели ситхинской ( Picea sitchensis ), еще одной важной с коммерческой точки зрения хвойной породы, широко выращиваемой в Великобритании.

Полный список видов растений, восприимчивых к P.ramorum доступна на Информационном портале здоровья растений Великобритании.

Болезнь Раморум на каштане сладком

Уже несколько лет известно, что P. ramorum может инфицировать европейские сладкие каштаны. Однако до 2015 года единственными зараженными экземплярами были деревья, подвергшиеся сильному воздействию инокулята (большие дозы спор), поскольку они стояли рядом с сильно зараженными другими растениями. Обычно это были лиственницы или кустарники рододендронов.

Затем в 2015 году зараженные деревья каштана были обнаружены на небольшом количестве участков в юго-западной Англии, в основном в Девоне и Корнуолле, где поблизости не было других зараженных растений.Наши ученые работают над тем, чтобы понять, как это произошло, в том числе, могли ли деревья изначально быть заражены дальним распространением P. ramorum через влажные воздушные потоки. Болезнь могла затем начать «зацикливаться» среди групп каштанов, то есть распространяться от каштана к каштану. Это могло произойти, потому что зараженные листья каштана сладкого действительно генерируют споры P. ramorum .

Количество затронутых каштанов относительно невелико, но исследование позволит нам предоставить наилучшие рекомендации по управлению для производителей и владельцев и свести к минимуму возможность распространения болезни.

Тем временем надзор за сладкими каштанами был усилен, и мы подготовили руководство в нашем руководстве Phytophthora для владельцев и менеджеров каштанов, чтобы распознавать, когда у их сладких каштанов может быть болезнь раморум.

Любой, кто подозревает, что нашел его на сладких каштанах, должен немедленно сообщить об этом. (См. « Сообщить о наблюдении » ниже).

Распределение

Болезнь Раморум обнаружена в большинстве регионов Великобритании, но чаще регистрируется в более влажных западных регионах.

• На карте вспышек в Соединенном Королевстве показаны места, где болезнь раморум была подтверждена или предположительно обнаружена на лиственницах. Цветные точки обозначают период с апреля по март, когда инфекция была подтверждена или предполагалась.
• Отчет о ситуации с лиственницей обобщает последнюю ситуацию с болезнями лиственниц в Великобритании.
• В отчете о ситуации со сладкими каштанами обобщается ситуация со сладкими каштанами в Англии.

Более подробную информацию и рекомендации для Шотландии, Уэльса и Северной Ирландии можно получить по телефону:

.

Угроза

Болезнь Раморум может нанести значительный ущерб нашей природной среде и растительной промышленности, если бы ей позволили развиваться без вмешательства.Вот почему мы советуем, а органы по охране здоровья растений требуют принятия быстрых мер по исправлению положения, где бы и когда бы оно ни было обнаружено.

Перспективы будут зависеть от того, как возбудитель адаптируется к своим хозяевам в Великобритании. Если появятся новые генотипы, которые увеличат его воздействие на нынешние виды-хозяева, в худшем случае мы можем потерять большую часть наших лиственниц и каштанов, особенно тех, которые растут в более влажных западных регионах. Возможна также возможность заражения патогеном других видов.

До обнаружения болезни на лиственнице в 2009 г. лиственничные леса занимали около 154 000 га, или 5% общей площади лесов Великобритании. Следовательно, общее экологическое, ландшафтное и экономическое воздействие значительных потерь лиственницы не будет большим в контексте всей Великобритании, хотя оно будет и было значительным на местном и региональном уровнях.

Сладкий каштан занимает около 29 000 гектаров лесных массивов, и потеря деревьев-ветеранов этого вида была бы значительной потерей наследия, и в большей степени, чем лиственничные леса.(Большинство лиственниц были посажены после 1945 года, поэтому старых лиственниц мало.)

Если, однако, болезнь раморума начнет поражать другие широко используемые виды в значительном количестве, воздействие может быть более значительным.

Также вызывает озабоченность тот факт, что несколько других лесных и вересковых видов восприимчивы к P. ramorum и его дальнему родственнику, P. kernoviae . Черника ( Vaccinium myrtillus ; также известная как черника и брусника) была обнаружена зараженной в дикой природе.Черника тесно связана с черникой, и если патоген заразит чернику, экономические последствия для черничной промышленности могут быть серьезными.

Лабораторные испытания показали чувствительность других видов растений. Вереск также восприимчив, хотя в лабораторных испытаниях дикие виды показали лишь низкую восприимчивость, в то время как декоративные сорта были более восприимчивы. Вереск и черника являются экологически важными растениями, и если какой-либо из патогенов нанесет им значительный ущерб, это будет иметь серьезные последствия для их местообитаний.

Эти риски и неопределенности являются одной из причин, по которым мы советуем, а органы лесного хозяйства проводят почти непрерывное наблюдение за болезнью раморум и быстро реагируют на вспышки. В результате большая часть наших лиственничных лесов остается здоровой*, а показатели новых случаев заражения лиственницы в Англии и Шотландии в последние годы имеют тенденцию к снижению.

Несомненно, через несколько лет эта тенденция изменится на противоположную, преимущественно когда погода будет особенно способствовать распространению и заражению в критические периоды. Например, считается, что благоприятная погода для распространения P. ramorum стала причиной повторного появления болезни в Уэльсе в 2017 году.

Однако при условии, что все стороны будут продолжать проявлять бдительность и оперативно реагировать на новые данные, есть основания полагать, что мы достигнем нашей стратегической цели. Это поддерживать болезнь на уровне, с которым можно эффективно бороться в более засушливых восточных частях Британии в ходе обычного лесопользования.

* По состоянию на 31 марта 2016 года Национальная инвентаризация лесов зарегистрировала 111 300 га лиственничных лесов.Тем не менее, это включало бы участки лиственницы, которые должны были быть вырублены для борьбы с болезнью раморум, которые вряд ли будут повторно засажены лиственницей.

Идентификация и симптомы

Инфекция P. ramorum на хвойных деревьях, таких как лиственница, может принимать две формы — заражение коры и заражение листвы.

Симптомы на коре включают поражения, иногда известные как кровоточащие язвы, которые выделяют или выделяют темную жидкость из зараженной коры, как показано на ветке западного болиголова, изображенной выше. Этот экссудат может засыхать до образования корки на коре. Внутренняя кора под этим кровоточащим участком обычно обесцвечивается и отмирает. Деревья с отмиранием ветвей также могут иметь многочисленные смолистые язвы на ветвях (на фото) и верхней части ствола. Деревья погибают, когда поражения становятся обширными на основном стволе.

Также могут быть поражены побеги и листва, видимые как увядшие, увядшие кончики побегов (вверху) с почерневшими иголками. Зараженные побеги преждевременно сбрасывают хвою.

На других растениях в основном поражает листья и побеги, особенно декоративных кустарников, таких как рододендрон, калина, пиерис и камелия.Зараженные листья некоторых из этих лиственных хозяев (листья и побеги) могут продуцировать много спор, и в достаточном количестве эти споры могут затем заразить кору некоторых видов деревьев.

Типичные симптомы рододендрона включают почернение листьев, увядание побегов и отмирание. На отдельных листьях почернение черешка листа обычно распространяется на лист вдоль средней жилки, хотя может встречаться и почернение на кончике листа. Развитие болезни может быть настолько быстрым, что побеги увядают, а листья свисают.

Наше руководство Phytophthora содержит более подробные рекомендации по распознаванию симптомов болезни раморума на ряде деревьев и других растений, произрастающих в лесах и лесных массивах.

Сообщить о наблюдении

О предполагаемых случаях болезни раморума на деревьях или других лесных растениях необходимо сообщать в органы лесного хозяйства. Если вы считаете, что видели болезнь раморума на дереве или другом лесном или лесном растении, пожалуйста, ознакомьтесь с руководством по идентификации и симптомам в нашем руководстве Phytophthora , прежде чем делать отчет.

• В Англии, пожалуйста, отправьте электронное письмо в Комиссию по лесному хозяйству или позвоните по телефону 0300 067 4000. Если возможно, приложите хотя бы одну четкую, хорошо освещенную фотографию симптомов с вашим отчетом по электронной почте.
• В Шотландии или Уэльсе воспользуйтесь нашим онлайн-инструментом оповещения о болезнях деревьев.
• В Северной Ирландии используйте TreeCheck, общеирландский инструмент отчетности о заболеваниях деревьев.

Обратите внимание, что Tree Alert и TreeCheck требуют загрузки фотографий симптомов.

Следует сообщать о подозрениях на появление болезни раморума на других растениях за пределами лесных массивов или на растениях (включая древесные растения), перемещаемых в коммерческих целях:

Разворот

Споры P. ramorum могут распространяться на несколько миль в тумане, воздушных потоках, водотоках и брызгах дождя. Он также может распространяться на обувь, лапы собак, инструменты, оборудование и колеса транспортных средств, включая колеса велосипедов и горных велосипедов. Перемещение зараженных растений также является ключевым средством его распространения на большие расстояния.

Локальное перемещение на короткие расстояния диких животных, таких как олени и кабаны, также возможно, хотя мало что указывает на то, что белки могут переносить P. ramorum с дерева на дерево.

Вполне вероятно, что во многих случаях он первоначально распространился на лиственницы от Rhododendron ponticum , инвазивного неместного вида, присутствующего во многих лесных массивах Великобритании. R. ponticum очень восприимчив к болезни раморум, и инфицированный рододендрон производит большое количество спор, которые распространяют инфекцию.Зараженные лиственницы, в свою очередь, также производят очень большое количество спор — намного больше, чем рододендроны, — и потоки влажного воздуха могут распространяться на многие мили от высоких деревьев.

Некоторые виды растений, которые могут быть заражены P. ramorum , не производят споры, которые распространяют болезнь. Они известны как терминальные хосты; те, которые производят споры, называются спорулирующими хозяевами.

Предотвращение и минимизация распространения

Общественность

Посетители лесов, лесов, парков и скверов могут помочь свести к минимуму распространение болезни раморума и других болезней растений.Они могут сделать это, смахнув землю, грязь и листву со своей обуви и колес, включая колеса автомобилей, велосипедов, горных велосипедов, детских колясок и инвалидных колясок, прежде чем покинуть место происшествия. Затем они должны постирать эти предметы дома перед посещением другого подобного сайта.

Многие маршруты для катания на горных велосипедах проходят в лиственничных лесах, и мы настоятельно рекомендуем горным велосипедистам перед отъездом использовать средства для мытья на месте, доступные во многих трейл-центрах. Если вы приехали с грязным велосипедом, перед входом в лес воспользуйтесь душевой кабиной.

При посещении таких мест парковайте автомобили на твердом покрытии, таком как асфальт, бетон или гравий, а не на покрытых травой поверхностях, где это возможно.

Промышленность

Существуют дополнительные требования биобезопасности для людей, которые работают в лесах и лесах или управляют ими, таких как лесники, работники лесного хозяйства, хирурги и лесовозы. В нашем руководстве Phytophthora содержится подробное руководство по требуемым или рекомендуемым мерам.

Контроль и управление

Лекарство от болезни раморум не найдено, и нет доступных эффективных химических средств.Существуют фунгициды, которые могут подавлять симптомы, но ни один из них не убивает патоген.

Таким образом, целью любого подхода к контролю должно быть предотвращение или минимизация дальнейшего распространения болезни раморум и причиняемого ею ущерба. Наилучший доступный научный совет — удалить и убить живую растительную ткань, от которой зависит размножение организма. Это означает, что зараженные спорообразующие растения, такие как лиственницы, должны быть вырублены или иным образом уничтожены как можно быстрее после обнаружения болезни.По возможности это нужно сделать до начала следующего весеннего или осеннего периода спороношения на хвое. Рубки для борьбы с болезнями известны как санитарные рубки.

Мы опубликовали советы и рекомендации в нашем руководстве Phytophthora , чтобы помочь владельцам и менеджерам лесных угодий, а также другим представителям лесной промышленности сделать все возможное для предотвращения или сведения к минимуму распространения болезни. Он включает рекомендации о том, каких видов следует избегать, а какие учитывать, а также о других факторах при пересадке деревьев на пострадавших участках.

Официальная акция

Учитывая серьезность этого заболевания и следуя нашим советам, Комиссия по лесному хозяйству, Департамент лесного хозяйства Шотландии, Департамент природных ресурсов Уэльса и Департамент сельского хозяйства, окружающей среды и сельских районов Северной Ирландии (DAERA) направляют официальные уведомления о состоянии растений (SPHN) владельцам или менеджеры пострадавших лесов. Эти уведомления требуют, чтобы они уничтожали зараженные и близлежащие деревья. Близлежащие деревья включены в уведомления, потому что, хотя они могут не проявлять симптомов болезни, опыт показывает, что во многих случаях некоторые из них на самом деле заражены.

SPHN являются полезным инструментом управления, и получение одного из них не означает, что владелец или управляющий лесным угодьем каким-либо образом виноват в заболевании. Это также не означает, что у них есть какие-либо проблемы, хотя несоблюдение уведомления может привести к принудительным действиям и судебному преследованию.

Forestry England, Forestry & Land Scotland, Natural Resources Wales и Лесная служба заразились раморумом в государственных лиственничных лесах, которыми они управляют, и провели санитарные рубки на пораженных участках.

В стратегии контроля учитываются интересы частного сектора. Это делается через представительство Конфедерации лесной промышленности (ConFor) и Ассоциации лесных товаров Великобритании (UKFPA) в нашей рабочей группе по лицензированию процессоров P. ramorum , а также посредством встреч с ключевыми представителями сектора.

Официальные действия частично основаны на трех зонах риска, на которые разделена Великобритания, исходя из риска распространения возбудителя в каждой из них.Границы зоны контролируются. Мы фиксируем скорость распространения патогена на основе уведомлений и аэрофотосъемки, и время от времени на карту вспышек могут вноситься обновления. (См. «Распространение» выше).

В зависимости от зоны риска и страны, в которой находится участок, применяются различные правила, регулирующие вырубку и пересадку деревьев. Наше руководство Phytophthora содержит дополнительную информацию.

Мы и органы лесного хозяйства благодарим частных владельцев лесных угодий за их общественное сотрудничество со стратегией.Без такого сотрудничества вполне вероятно, что болезнь поразила бы гораздо большую площадь деревьев, лесов и лесов.

Перемещение и обработка поврежденной древесины

Любое перемещение в Великобритании пораженной фитофторой древесины требует лицензии на перемещение от соответствующего органа лесного хозяйства. Это делается для того, чтобы свести к минимуму риск распространения болезни во время коммерческого лесоводства и лесозаготовок. Сюда входит древесина из лесного массива и любое последующее перемещение затронутого материала с лесопилки или другого перерабатывающего предприятия.Древесину с зараженных деревьев можно сдавать только на перерабатывающее предприятие, например на лесопилку, имеющую лицензию на переработку.

Наше руководство Phytophthora содержит полную информацию о схеме лицензирования.

Диагностика

Для диагностики заболевания используется сочетание визуального осмотра обученными наблюдателями и полевых испытаний симптоматической коры и хвои с помощью тестовых наборов, известных как устройства бокового потока (LFD, на фото ниже).

Это имеющиеся в продаже карманные наборы, которые могут через 5–10 минут определить, присутствует ли в ткани микроорганизм Phytophthora .Лабораторные тесты необходимы для выделения возбудителя или обнаружения его ДНК для подтверждения точного вида Phytophthora .

Лабораторные тесты для диагностики P. ramorum в коре и листве лиственницы дают окончательный результат только примерно в 80% симптоматического материала, отправленного на тестирование, поэтому мы не можем полагаться исключительно на лабораторные тесты. Когда тестирование не дает убедительных результатов, предполагается болезнь раморума там, где на нее указывают все остальные признаки.

Если, однако, лабораторный анализ подтвердит, что другой организм вызывает симптомы, участок не будет классифицироваться как зараженный согласно P.ramorum , но будет находиться под наблюдением.

Происхождение и предыстория

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что P. ramorum произрастает в некоторых частях Азии и был обнаружен во Вьетнаме. Невозможно узнать, когда он впервые попал в Великобританию и откуда. Однако, вопреки первоначальному предположению, наши исследования показали, что он не прибыл сюда из США, где встречаются различные генетические варианты возбудителя.

В настоящее время известно, что в других европейских странах, включая Германию и Нидерланды, еще в 1993 году на кустах был обнаружен неизвестный тогда Phytophthora .Они также, вероятно, были введены.

Первая находка в Великобритании была сделана на калине в феврале 2002 года в садовом центре в Сассексе. Первая находка взрослого дерева в Великобритании была сделана на 100-летнем южном красном дубе ( Quercus falcata ) в ноябре 2003 г. Англия в 2009 году.

Существует четыре различных генетических линии P. ramorum в Северной Америке и Европе, каждая из которых в значительной степени является клональной.Их называют североамериканскими линиями 1 и 2 (NA1 и NA2) и европейскими линиями 1 и 2 (EU1 и EU2).

Первоначально в Великобритании и континентальной Европе была известна только линия EU1, но в 2011 году в Юго-Западной Шотландии и Северной Ирландии была обнаружена четвертая эволюционная линия, EU2. EU2 генетически и поведенчески отличается от гораздо более распространенного EU1, и наличие двух линий предполагает, по крайней мере, две отдельные интродукции P. ramorum в Великобританию: EU1, вероятно, прибыл до EU2.

Болезнь

Ramorum была также обнаружена в Бельгии, Чехии, Дании, Франции, Германии, Ирландии, Италии, Норвегии, Испании (включая Балеарские острова), Словении, Швеции и Нидерландах.

Связанные страницы

 

Научный обзор: влияние Biochar на болезни

Обзор

Наша работа с лесоводами и коммерческими производителями в качестве поставщиков и партнеров вне всяких сомнений доказала, что наши обогащенные биоугольные продукты оказывают положительное влияние на здоровье всех растений.

Но также был проведен ряд исследований способности биоугля подавлять болезни, которые полностью не зависят от Carbon Gold.

Ниже приводится краткое изложение трех таких исследований, их методологий и результатов. Мы также включили некоторые основные моменты, если вы просто хотите прочитать краткое изложение.

Основные моменты

• Биоуголь, добавленный в почвенные смеси на основе торфа и перлита в количестве 5%, способствовал устойчивости к язвам стеблей, вызываемым двумя видами Phytophthora sp. – красный дуб и красный клен изучались как важные виды ландшафтных деревьев в США (Zwart and Kim, 2012).
• Biochar, добавленный в количестве 3 и 5% по весу к помидорам и перцу, выращенным в контейнерах с почвой или субстратом из кокосового туфа, смог значительно уменьшить симптомы листьев двух распространенных грибковых патогенов мучнистой росы и серой гнили. Целые растения перца через 60 дней имели 59% заражения мучнистой росой без биоугля и только 17% заражения 5% биоугля. Серая гниль в томатах через 59 дней значительно снизилась с 66% заражения без лечения до 2% с 3% биоугля.Широкие клещи также присутствовали в туннелях, где проходило испытание. Biochar в урожае перца снизил инфекцию с 18% (без biochar) до 6% заражения листьев с 5% biochar. Авторы предположили, что низкие уровни остаточных смол в биоугле вызывают индуцированную устойчивость к болезням и вредителям (Elad et al. 2010).
• Джайсвал и др. (2018) обнаружили, что экссудаты ферментов патогенных грибов (исследован Fusarium oxysporum ) адсорбировались и существенно деактивировались двумя биоуглями (эвкалиптовым деревом и биоуглем из отходов растений перца из теплицы).Экссудаты были протестированы на рассаде томатов и показали значительное снижение корневой гнили. Это было выдвинуто как один, но не единственный эффект биоугля на снижение болезней, передающихся через почву.

Тематические исследования

Zwart and Kim (2012) выращивали саженцы красного дуба ( Quercus rubra ) в 0,5-литровых горшках и красного клена ( Acer rubrum ) в 2,5-литровых горшках со смесью торфа/перлита с 0,5,10 или 20% добавленного биоугля. Эти деревья являются важными ландшафтными видами в восточной и центральной части США.

Используемый биоуголь был изготовлен из древесины сосны с содержанием углерода 63%. Растения инокулировали с использованием метода стволовых ран патогенами Phytophthora cactorum и Phytophthora cinnamomi , вызывающими поражение стволов деревьев.

Измерения устойчивости проводились через 65 дней для дуба и 108 дней для клена. Некроза у неинокулированных контрольных сеянцев деревьев не было. Как для дуба, так и для клена добавление 5% биоугля было оптимальным для уменьшения поражений и биомассы ствола по сравнению с обработкой без биоугля.

Водный потенциал был измерен в конце эксперимента на дубе, который показал, что максимальное движение воды произошло при обработке 5% биоуглем (виды Phytophthora повреждают клетки ксилемы, уменьшая поток воды).

Поражения не были предотвращены биоуглем, но авторы пришли к выводу из этой и другой опубликованной работы, что биоуголь придавал некоторую форму устойчивости к патогенам.

Авторы предполагают, что гормезис, т.е. низкий уровень фитотоксичных соединений (из биоугля), стимулировал механизм роста/защиты растений.Помимо уровня включения 5%, никаких дополнительных преимуществ обнаружено не было.

Элад и др. (2010) рассматривают влияние биоугля на защитные механизмы растений и, вероятно, были первыми, кто сделал это. Подавление болезней от применения биоугля может быть связано с:

• Стимуляция микробов, защищающих от патогенов
• Стимулирование роста растений путем подачи дополнительных питательных веществ, изменения pH питательной среды и т. д.
• Индуцированная устойчивость растений к болезням путем стимуляции механизмов защиты растений от болезней

Эксперимент состоял из растений томата и перца, выращенных в 1-литровых горшках либо в песчаной почве с низким содержанием органических веществ, либо в горшках, содержащих смесь кокосового волокна/туфа с добавлением 0, 1, 3 и 5% биоугля по весу.

Растения выращивали в течение 1-2 месяцев, затем инокулировали на их листья мучнистую росу ( Leveillula taurica) или серую гниль ( Botrytis cinerea) . Растения перца также были естественным образом заражены широкими клещами ( Polyphagotarsonemus latus ), которые вызывают деформацию и образование пузырей на листьях.

Через 60 дней после заражения на листьях перца было значительно меньше мучнистой росы при 3 и 5% биоугля как в почве, так и в кокосовой смеси.Целые растения перца через 60 дней имели 59% заражения без биоугля, 23% с 3% смесью биоугля и 17% со смесью 5% биоугля.

Естественная инфекция перца широким клещом была значительно снижена в смесях с 3 и 5% биоугля через 57 дней (перец, в смеси с кокосовой стружкой): в смеси с 0% биоугля было инфицирование на 18%, в смеси с 3% биоугля инфекция было снижено до 9%, а в смеси с 5% биоугля заражение листьев клещами было снижено еще больше до 6%.

Серая гниль на растениях томата также значительно уменьшилась в смесях с 3 и 5% биоугля.Через 59 дней у необработанных контрольных растений было инфицировано 66%, что является огромным отличием от смеси биоугля с 3%, у которой было только 2% заражения.

Что касается причин, по которым биоуголь оказывает такой эффект, концентрации питательных веществ в листьях были одинаковыми при различных обработках, а питание и водный стресс не учитывались как способствующие факторы, поскольку все растения подкармливались и поливались до 25-50% избытка.

Авторы предположили, что остаточные смолы в биоугле вызывают у растений механизм индуцированной устойчивости.В неопубликованных данных авторы обнаружили, что биоуголь увеличивал популяции бактерий, дрожжей, актиномицетов и полезных грибов, например. Trichoderma harzianum как в почве, так и в кокосовой смеси. Это увеличение может быть связано с биоцидными агентами низкого уровня в биоугле или биоугле, действующем как убежище для полезной микробиологии. Низкоуровневые токсины в биоугле могли стимулировать стресс у растений или вследствие действия химических элиситоров вызывать устойчивость к этим двум грибковым патогенам.

  Джайсвал и др.  (2018) , работающий в Центре Volcani, Израиль, рассмотрел дополнительные причины, по которым биоуголь может воздействовать на патогены растений (та же группа, что и Elad et al. 2010).

В этой работе они показали, что биоуголь может деактивировать ферменты, разрушающие клеточную стенку, вырабатываемые почвенными патогенами (CWDE). CWDE, продуцируемые патогенными почвенными грибами, растворяют и разрушают растительные клетки и позволяют патогену проникнуть в растение-хозяин.